謝海鋒[1]   勵(lì)梅芬[2] 張彩珍[2]

1中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)寧波有限公司 315012   2寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局315012    

 

摘 要：本文通過對(duì)3000克糖水葡萄罐頭（去皮去籽）葡萄組織軟化現(xiàn)象和少量糊化的原因進(jìn)行研究分析，提出了良好的前提方案和合理的生產(chǎn)工藝流程是確保CCP監(jiān)控有效性的重要因素，也為葡萄罐頭生產(chǎn)企業(yè)確定殺菌溫度時(shí)間、改進(jìn)流程提供有效的理論依據(jù)和措施。

關(guān)鍵詞：前提方案 工藝流程 CCP監(jiān)控

 

前  言：糖水葡萄罐頭所含的營(yíng)養(yǎng)成分基本上與新鮮葡萄相同，一般含糖、維生素、無機(jī)鹽、無機(jī)酸等成分，酸甜可口，深受消費(fèi)者喜愛。然而，近幾年出口的3000克糖水葡萄罐頭（去皮去籽）由于罐頭內(nèi)容物組織軟化和少量糊化現(xiàn)象，經(jīng)常遭進(jìn)口國(guó)退貨或產(chǎn)品無法出口。通過對(duì)某罐頭廠在2004年生產(chǎn)的一批3000克糖水葡萄罐頭（去皮去籽），由于葡萄組織偏軟和少量糊化使整批罐頭無法出口的產(chǎn)品進(jìn)行了分析研究，發(fā)現(xiàn)罐內(nèi)組織軟化是由微生物引起，并且在該批產(chǎn)品中分離得到了4株真菌，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心菌種鑒定，確定為海棗曲霉（Aspergillus Ph oenicis）1株、薩氏曲霉（Aspergillus sydowii）2株、弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）1株。對(duì)這4株真菌進(jìn)行了耐熱試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些菌株均有一定的耐熱性，證明該產(chǎn)品是由于生產(chǎn)工藝中的殺菌溫度不足造成的葡萄組織軟化，找出了殺菌溫度時(shí)間的確定與生產(chǎn)工藝流程的設(shè)置與食品安全體系的前提方案有著緊密的聯(lián)系。目前，上述研究未見報(bào)道。

通過檢出真菌并研究其耐熱性，揭示了與文獻(xiàn)中闡述的真菌菌絲及酵母菌對(duì)熱的耐受力與不產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌相同，在60℃中10min既被殺死而酵母與霉菌的孢子耐熱性較菌體高出5-10℃【3】不符合，為3000克糖水葡萄罐頭（去皮去籽）的殺菌溫度的確定提供有效的理論依據(jù)，闡明了良好的前提方案和合理的生產(chǎn)工藝流程是確保CCP監(jiān)控有效性的重要因素。

1材料與方法

1.1原料：

3000g/罐的同一批去皮去籽葡萄罐頭共25罐，由浙江寧波某罐頭廠提供。

1.2培養(yǎng)基與試劑

孟加拉紅瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、酸性肉湯、麥芽浸膏肉湯等由北京陸

橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.3微生物分離及感觀檢查

第一次分離：將儲(chǔ)存期為60d的葡萄罐頭1罐，以無菌操作開罐，取葡萄湯

汁經(jīng)100℃15min加熱處理，待冷卻后每平皿吸取1ml葡萄湯汁傾注15ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂，共接種4個(gè)平皿，分2組，分別37℃、55℃培養(yǎng)5-7d分離耐熱芽孢菌并做感觀檢驗(yàn)。

第二次分離：將儲(chǔ)存期為100d的葡萄罐頭6罐，以無菌操作開啟，各吸取葡萄汁1ml分別接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯、虎紅瓊脂平皿中，各做2個(gè)重復(fù)，27℃+-1℃培養(yǎng)7-15d后將營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)出的菌接種于虎紅瓊脂平皿中，做進(jìn)一步分離純化并做感觀檢驗(yàn)。

第三次分離：將儲(chǔ)存期為180d的葡萄罐頭18罐，以無菌操作開啟，各吸取葡萄汁1ml分別接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥芽浸膏肉湯、酸性肉湯中，虎紅瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，每罐每種培養(yǎng)基均做2個(gè)重復(fù)，分別置于37℃和27℃±1℃培養(yǎng)7-15d并做感觀檢驗(yàn)。

1.4鏡檢

第一、二次送檢樣品分別做革蘭氏染色鏡檢，第三次送檢樣品分別做革蘭氏染色和活菌懸滴（壓片）鏡檢。

1.5菌種鑒定

由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心菌種鑒定。

1.6耐熱試驗(yàn)

從第一次、第二次送檢樣品中分離得到的3株霉菌分別接種于虎紅瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，每株菌接4個(gè)平皿，27℃±1℃培養(yǎng)45d待平板上長(zhǎng)出孢子后做耐熱試驗(yàn)，用葡萄罐頭的糖水100ml洗下2個(gè)平板的霉菌，每株菌各制成2個(gè)重復(fù)懸液進(jìn)行耐熱試驗(yàn)；并把第一次檢樣中分離到的1株霉菌用上述27℃±1℃培養(yǎng)45d的長(zhǎng)菌平皿直接放入高壓滅菌鍋進(jìn)行耐熱試驗(yàn)，再進(jìn)行直接培養(yǎng)與分離。第三次送檢樣品中發(fā)現(xiàn)的菌落塊用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)后轉(zhuǎn)營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)9D的菌，用葡萄糖水洗下后做耐熱試驗(yàn)并用不接菌的葡萄罐頭的糖水做空白對(duì)照。加熱處理后的懸液分別接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂、虎紅瓊脂中，5-7d培養(yǎng)觀察結(jié)果。

2.結(jié)果與討論

2.1微生物的檢出

三次送檢的樣品罐頭糖水葡萄湯汁稍混濁，但屬正常范圍，PH值、葡萄的外觀、色澤、氣味均屬正常，組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)稍偏軟。但在第三次送檢罐頭中第7罐發(fā)現(xiàn)一塊白色菌落塊，直徑1.5cm左右，平坦的漂浮在湯汁中，罐頭湯汁稍混濁在湯汁中有少量葡萄碎屑。組織與其它罐相比更軟些，但葡萄粒還是整顆。3次打開的罐頭，葡萄湯汁的糖度均為20.3%左右，PH值均在3.69-3.72之間。

三次送檢的樣品每罐湯汁采用直接涂片革蘭氏染色鏡檢均為陰性。但在第三次送檢樣品每罐同時(shí)做活菌懸滴（壓片）鏡檢，在第3、7罐經(jīng)活菌懸滴壓片不染色直接鏡檢，發(fā)現(xiàn)罐內(nèi)有極少孢子和短節(jié)菌絲體。可見在同罐頭中不同的制片方法，鏡檢觀察得到的結(jié)果不同，究其原因葡萄罐頭湯汁的糖度高達(dá)20.3%左右，挑取的湯水在干燥固定后形成厚厚的一層糖漿，革蘭氏染色過程易被水沖洗掉，即使罐內(nèi)有菌也不易被染上，從而影響觀察結(jié)果。從白色菌落花流水塊中切割一點(diǎn)做活菌懸滴壓片鏡檢發(fā)現(xiàn)繁茂的菌絲體，菌落塊符合絲狀真菌的生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生繁茂的分枝而構(gòu)成真菌的菌落【4】。而且菌絲枝節(jié)的生長(zhǎng)總是向前或朝向菌落邊緣這是真菌生長(zhǎng)規(guī)律。

在第一次檢測(cè)的葡萄罐頭經(jīng)100℃15min加熱處理后經(jīng)37℃和55℃培養(yǎng)5-7天，放37℃培養(yǎng)的2個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿中均有霉菌生長(zhǎng)，并不是芽孢菌。而55℃培養(yǎng)的2個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿中無任何微生物生長(zhǎng)。而且發(fā)現(xiàn)每ml葡萄罐頭的糖水中約有霉菌12個(gè)左右，均勻地頒生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿中間用L-1表示，與罐內(nèi)條件吻合。而且在37°C培養(yǎng)5天后生長(zhǎng)而在55°C培養(yǎng)下卻不生長(zhǎng)，又喜歡偏酸性的環(huán)境，這些都符合霉菌的微生物學(xué)特性。

在第二次檢測(cè)的6個(gè)葡萄罐頭，分別做霉菌檢測(cè)，在孟加拉紅瓊脂平皿中無任何菌，但在第1、4、5罐的營(yíng)養(yǎng)肉湯中有菌生長(zhǎng)，將營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)出的菌轉(zhuǎn)接孟加拉紅瓊脂中，根據(jù)菌落形態(tài)特征確定為霉菌，其中1號(hào)2支菌株相同，4號(hào)、5號(hào)菌株相同，分別用L-2，L-3表示。

第三次送檢的18罐罐頭，取其糖水葡萄湯汁每罐分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯等五種培養(yǎng)基中，分別37℃和26℃±1℃培養(yǎng)7-15d后，未見任何微生物生長(zhǎng)。而在第7罐中發(fā)現(xiàn)一塊白色的真菌塊將其切割小塊，分別接種于虎紅瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯，分別放37℃和27℃培養(yǎng)，在虎紅瓊脂平皿中不見生長(zhǎng)，而在營(yíng)養(yǎng)肉湯中15d后檢出孢子，20d后可見芽管長(zhǎng)出短菌絲。該菌用L-4表示，白色的菌塊經(jīng)培養(yǎng)后長(zhǎng)出菌絲體，說明菌落塊在適宜生長(zhǎng)的環(huán)境能復(fù)活，罐頭中的菌落塊完整的漂浮在罐頭湯汁中，說明不是帶進(jìn)去的而是罐內(nèi)自身繁殖形成，這就表明了罐頭中有真菌存在，從三次接種培養(yǎng)來看，隨著在罐內(nèi)生長(zhǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)，接種罐數(shù)增長(zhǎng)，長(zhǎng)菌率反而降低說明到了一定的罐藏時(shí)間，由于氧氣的耗盡使真菌處于致死或休眠狀態(tài)。經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心菌種鑒定確定：L-1為海棗曲霉（Aspergillus Ph oenicis）、L-2、L-3為薩氏曲霉（Aspergillus sydowii）、L-4為弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）

2.2真菌的耐熱性

經(jīng)100℃耐熱試驗(yàn)后把L-1、L-2、L-3、L-4的4株菌懸液按耐熱試驗(yàn)時(shí)間不同，分別轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)瓊脂、虎紅瓊脂培養(yǎng)基中，并同時(shí)與耐熱試驗(yàn)后菌懸液一起放37℃、27℃經(jīng)5-7d培養(yǎng)觀察結(jié)果。發(fā)現(xiàn)L-1、L-2、L-3均能耐受100℃25min熱處理。而在116℃20min耐熱試驗(yàn)后的菌懸液經(jīng)接種培養(yǎng)后均不能存活。由于L-1菌在100℃所做的耐熱試驗(yàn)時(shí)間中全部生長(zhǎng)，故把該菌用45d培養(yǎng)后的真菌平皿直接放在高壓滅菌鍋116℃20min耐熱試驗(yàn)，然后把耐熱處理過的L-1真菌平皿繼續(xù)培養(yǎng)27℃10d后，轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面和營(yíng)養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)該菌仍然存活，可見相同溫度、相同時(shí)間、相同菌株，不同耐熱的環(huán)境菌的耐熱性不同，在瓊脂平皿上生長(zhǎng)的真菌由于是不直接接觸液面耐熱性強(qiáng)。

2.3內(nèi)容物組織軟化原因分析

綜上所述罐內(nèi)少量真菌利用糖水葡萄中的多糖，在有糖源程序環(huán)境中能自身緩慢生長(zhǎng)，在繁殖過程中它可以分解果肉組織中的果膠物質(zhì)，降解果膠的多糖鏈?zhǔn)蛊咸呀M織軟化，與資料所述酵母菌和霉菌都會(huì)引起食物不同程度分解和腐敗【6】相吻合。而罐內(nèi)真菌在缺氧（罐內(nèi)有3mm頂隙）或無氧條件下只能利用已糖作為碳源，氨基酸作為氮源利用自身儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物作為呼吸作用的底物，因?yàn)橹两駴]有找到專性厭氧的真菌所以繁殖到一定程度后氧氣耗盡，開始處于致死或休眠狀態(tài)。因此罐內(nèi)真菌由于環(huán)境因素只能輕微分解使葡萄組織軟化，未達(dá)到腐敗期即使進(jìn)入休眠或死亡期，少量葡萄組織糊化是由于污染嚴(yán)重，罐內(nèi)含菌量高。

2.4工藝流程的改進(jìn)

從葡萄組織軟化、葡萄罐內(nèi)真菌檢出、真菌的耐熱性等綜合分析，說明， 25min/88-90℃，中心溫度達(dá)到79℃±0.5℃不足以徹底殺滅用傳統(tǒng)的葡萄罐頭生產(chǎn)工藝流程生產(chǎn)出來的產(chǎn)品。但如果提高殺菌溫度和時(shí)間，會(huì)造成葡萄罐頭的組織偏軟、影響口味、降低營(yíng)養(yǎng)。為了達(dá)到既能保證殺菌效果，又能滿足組織、口味不受影響，我們只有在生產(chǎn)工藝流程上下功夫。

通常含菌量對(duì)滅菌效果有很大影響，因此防止生產(chǎn)過程菌的交叉污染，控制生產(chǎn)過程中的菌量，對(duì)殺菌溫度時(shí)間的確定有極大的關(guān)系。傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝流程是：原料驗(yàn)收 →清洗消毒→剪枝選果（包括去爛果）→漂燙冷卻→去皮去籽→ 燈檢 → 挑選分級(jí)→淘洗 →瀝水→裝罐稱重→熱燙→加湯→封口→殺菌冷卻→揩聽入庫 。這里可以看到，傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝流程由于原料驗(yàn)收后未進(jìn)行挑選，直接清洗導(dǎo)致爛果在清洗時(shí)真菌擴(kuò)散，造成交叉污染，影響了最后的殺菌效果。所以，改進(jìn)工藝流程線路把清洗消毒與剪枝選果進(jìn)行交換，使霉?fàn)�果在清洗消毒前去除，防止真菌擴(kuò)散。生產(chǎn)工廠可以在原料驗(yàn)收后首先剪枝選果，把原料剪成4-8小枝，同時(shí)去除霉黑點(diǎn)、傷爛、病蟲害、破裂果等，然后把剪枝后的果實(shí)先淋2-3min,再用0.05%高錳酸鉀液浸5min，這樣可控制菌量在生產(chǎn)過程中擴(kuò)散和交叉污染，保持原料和半成品的新鮮度，確保殺菌工序的殺菌效果。

總之，糖水葡萄罐頭因采用低溫連續(xù)殺菌，故必須采用食品安全管理體系，嚴(yán)格科學(xué)地做好工藝流程中的衛(wèi)生和消毒工作，控制生產(chǎn)過程中的菌量，把罐頭微生物的安全性把關(guān)在殺菌前，有效保證產(chǎn)品質(zhì)量。

同樣在425g糖水桔子罐頭中分離出真菌和酵母菌。

3.結(jié)論：

⑴本實(shí)驗(yàn)在密封性、感官、PH正常的葡萄罐內(nèi)檢出了4株真菌，找到了使葡萄組織軟化的真正原因。其中薩氏曲霉（聚多曲霉）有文獻(xiàn)報(bào)道，能引起阻塞性支氣管曲霉病，也可以引起耳道曲霉病。研究其耐熱性，發(fā)現(xiàn)真菌的耐熱性超過文獻(xiàn)資料的理論和生產(chǎn)工藝中規(guī)定的殺菌耐熱溫度，為生產(chǎn)工藝流程線路的改變、殺菌溫度時(shí)間的確定提供了有價(jià)值的參考數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。

⑵良好的食品安全體系的前提方案、合理的生產(chǎn)工藝流程是確保關(guān)鍵控制點(diǎn)監(jiān)控有效性，確保食品安全的重要因素。

⑶審核員在食品安全體系認(rèn)證現(xiàn)場(chǎng)，在重點(diǎn)關(guān)注HACCP計(jì)劃和關(guān)鍵控制點(diǎn)時(shí)，也應(yīng)該關(guān)注生產(chǎn)工藝流程設(shè)置的合理性，系統(tǒng)地評(píng)價(jià)食品加工企業(yè)建立的食品安全管理體系的有效性、合理性。

⑷食品加工企業(yè)的生產(chǎn)工藝多種多樣，審核員不但應(yīng)具備食品安全體系的審核技術(shù)，更應(yīng)具備食品生產(chǎn)專業(yè)的理論和實(shí)踐知識(shí)、法律法規(guī)等知識(shí)。

 

 

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