在實(shí)驗(yàn)工作中,為使篩選達(dá)到事半功倍的效果,總的說(shuō)來(lái)可從以下幾個(gè)途徑進(jìn)行收集和篩選:

(1)向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株,從中篩選所需菌株.

(2)由自然界采集樣品,如土壤、水、動(dòng)植物體等,從中進(jìn)行分離篩選.

(3)從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株,如從醬油中分離蛋白酶產(chǎn)生菌,從酒醪中分離淀粉酶或糖化酶的產(chǎn)生菌等.該類(lèi)發(fā)酵制品經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇,具有悠久的歷史,從這些傳統(tǒng)產(chǎn)品中容易篩選到理想的菌株.

    菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別幾個(gè)步驟.

    自然界含菌樣品極其豐富,土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物,種類(lèi)數(shù)量十分可觀.但總體來(lái)講土壤樣品的含菌量最多.

 

一、從土壤中采樣

    土壤由于具備了微生物所需的營(yíng)養(yǎng)、空氣和水分,是微生物最集中的地方.從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株,空氣、水中的微生物也都來(lái)源于土壤,所以土壤樣品往往是首選的采集目標(biāo).一般情況下,土壤中含細(xì)菌數(shù)量最多,且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律:細(xì)菌(108)>放線(xiàn)菌(107)>霉菌(106)>酵母菌(105)>藻類(lèi)(104)>原生動(dòng)物(103),其中放線(xiàn)菌和霉菌指其孢子數(shù).但各種微生物由于生理特性不同,在土壤中的分布也隨著地理?xiàng)l件、養(yǎng)分、水分、土質(zhì)、季節(jié)而有很大的變化.因此,在分離菌株前要根據(jù)分離篩選的目的,到相應(yīng)的環(huán)境和地區(qū)去采集樣品.

(一)根據(jù)土壤特點(diǎn)

1. 土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況

    一般耕作土、菜園土和近郊土壤中有機(jī)質(zhì)含量豐富,營(yíng)養(yǎng)充足,且土壤成團(tuán)粒結(jié)構(gòu),通氣飽水性能好,因而,微生物生長(zhǎng)旺盛,數(shù)量多,尤其適合于細(xì)菌、放線(xiàn)菌生長(zhǎng).山坡上的森林土,植被厚,枯枝落葉多,有機(jī)質(zhì)豐富,且陰暗潮濕,適合霉菌、酵母菌生長(zhǎng)繁殖,微生物數(shù)量相應(yīng)也比較少.

從土層的縱剖面看,1～5cm的表層土由于陽(yáng)光照射,蒸發(fā)量大,水分少,且有紫外線(xiàn)的殺菌作用,因而微生物數(shù)量比5～25cm土層少;25cm以下土層則因土質(zhì)緊密,空氣量不足,養(yǎng)分與水分缺乏,含菌量也逐步減少.因此,采土樣最好的土層是5～25cm.一般每克土中含菌數(shù)約幾十萬(wàn)到幾十億個(gè),并且各種類(lèi)型的細(xì)菌和放線(xiàn)菌幾乎都能分離到.如好氣芽孢桿菌、假單胞菌、短桿菌、大腸桿菌、某些嫌氣菌等.但總的說(shuō)來(lái)酵母菌分布土層最淺,約5～10cm,霉菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層.

2. 土壤酸堿度和植被狀況

    土壤酸堿度會(huì)影響微生物種類(lèi)的分布.偏堿的土壤(pH7.0～7.5)環(huán)境,適合于細(xì)菌、放線(xiàn)菌生長(zhǎng).反之在偏酸的土壤(pH7.0以下)環(huán)境下,霉菌、酵母菌生長(zhǎng)旺盛.由于植物根部的分泌物有所不同,因此,植被對(duì)微生物分布也有一定的影響.如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C生產(chǎn)菌.葡萄或其他果樹(shù)在果實(shí)成熟時(shí),其根部附近土壤中酵母菌數(shù)量增多.豆科植物的植被下,根瘤菌數(shù)量比其他植被下占優(yōu)勢(shì).

3. 地理?xiàng)l件

    南方土壤比北方土壤中的微生物數(shù)量和種類(lèi)都要多,特別是熱帶和亞熱帶地區(qū)的土壤.許多工業(yè)微生物菌種,如抗生素產(chǎn)生菌,尤其是霉菌、酵母菌,大多從南方土壤中篩選出來(lái).原因是南方溫度高,溫暖季節(jié)長(zhǎng),雨水多,相對(duì)濕度高,植物種類(lèi)多,植被覆蓋面大,土壤有機(jī)質(zhì)豐富,造成得天獨(dú)厚的微生物生長(zhǎng)環(huán)境.

4. 季節(jié)條件

    不同季節(jié)微生物數(shù)量有明顯的變化,冬季溫度低,氣候干燥,微生物生長(zhǎng)緩慢,數(shù)量最少.到了春天隨著氣溫的升高,微生物生長(zhǎng)旺盛,數(shù)量逐漸增加.但就南方來(lái)說(shuō),春季往往雨水多,土壤含水量高,通氣不良,即使有微生物所需的溫度、濕度,也不利于其生長(zhǎng)繁殖.隨后經(jīng)過(guò)夏季到秋季,約有7～10個(gè)月處在較高的溫度和豐富的植被下,土壤中微生物數(shù)量比任何時(shí)候都多,因此,秋季采土樣最為理想.

(二)采樣方法

    用取樣鏟,將表層5cm左右的浮土除去,取5～25處的土樣10～25,裝入事先準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好.北方土壤干燥,可在10～30處取樣.給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱(chēng)、時(shí)間及其他環(huán)境條件.一般樣品取回后應(yīng)馬上分離,以免微生物死亡.但有時(shí)樣品較多,或到外地取樣,路途遙遠(yuǎn),難以做到及時(shí)分離,則可事先用選擇性培養(yǎng)基做好試管斜面,隨身帶走.到一處將取好的土樣混勻,取3～4撒到試管斜面上,這樣可避免菌株因不能及時(shí)分離而死亡. 

 

二、根據(jù)微生物生理特點(diǎn)采樣

1. 根據(jù)微生物營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型

    每種微生物對(duì)碳氮源的需求不一樣,分布也有差異.研究表明,微生物的營(yíng)養(yǎng)需求和代謝類(lèi)型與其生長(zhǎng)環(huán)境有著很大的相關(guān)性.如森林土有相當(dāng)多枯枝落葉和腐爛的木頭等,富含纖維素,適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng);在肉類(lèi)加工廠(chǎng)附近和飯店排水溝的污水、污泥中,由于有大量腐肉、豆類(lèi)、脂肪類(lèi)存在,因而,在此處采樣能分離到蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生菌;在面粉加工廠(chǎng)、糕點(diǎn)廠(chǎng)、酒廠(chǎng)及淀粉加工廠(chǎng)等場(chǎng)所,容易分離到產(chǎn)生蛋白酶、糖化酶的菌株.若要篩選以糖質(zhì)為原料的酵母菌,通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣.在篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí),由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠,因此,從上述樣品的腐爛部分及果園土中采樣較好.若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物,從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠(chǎng)附近采集樣品,容易得到滿(mǎn)意的結(jié)果.在油田附近的土壤中就容易篩選到利用碳?xì)浠�合物為碳源的菌�?Hartman等人曾從乙烯氯化物的工廠(chǎng)附近分離到一株以乙烯氯化物為碳源和能源的分枝桿菌.含1%乙烯氯化物的空氣通過(guò)該菌培養(yǎng)可除去93%的毒性.也有人從含油污泥中篩選出能以20#機(jī)械潤(rùn)滑油為惟一碳源的３株石油降解菌菌株,分別為動(dòng)膠菌屬(Zoogloea sp.)、氮單胞菌屬(Azomonas sp.)和假單胞菌屬(Pseudomonas sp.).當(dāng)然,也可將一種需要降解的物質(zhì)作為樣品中微生物的惟一碳源或氮源進(jìn)行富集,然后分離篩選.

    此外,不少微生物對(duì)碳源的利用是不完全專(zhuān)一的,如以油脂為碳源的某些脂肪酶產(chǎn)生菌同樣也可以分解淀粉或其他糖類(lèi)物質(zhì)獲得能源而生長(zhǎng).以石油等碳?xì)浠�合物為碳源的油田微生�?也可以利用一些糖類(lèi)為碳源.具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他樣品中也會(huì)存在.不過(guò)數(shù)量較少.

2. 根據(jù)微生物的生理特性

    在篩選一些具有特殊性質(zhì)的微生物時(shí),需根據(jù)該微生物獨(dú)特的生理特性到相應(yīng)的地點(diǎn)采樣.如篩選高溫酶產(chǎn)生菌時(shí),通常到溫度較高的南方,或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品;分離低溫酶產(chǎn)生菌時(shí)可到寒冷的地方,如南北極地區(qū)、冰窖、深海中采樣;分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣.因?yàn)樯詈Ｖ猩�活的微生物能耐很高的靜水壓,如從海中篩到一株水活微球菌(Micrococcus aquivivus),它能在600個(gè)大氣壓下生長(zhǎng).分離耐高滲透壓酵母菌時(shí),由于其偏愛(ài)糖分高、酸性的環(huán)境,一般在土壤中分布很少,因此,通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣.如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌.

三、特殊環(huán)境下采樣

1. 局部環(huán)境條件的影響

    值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和環(huán)境條件綜合因素的影響之外,還要受局部環(huán)境條件的影響.如北方氣候寒冷,年平均溫度低,高溫微生物相對(duì)較少.但在該地區(qū)的溫泉或堆肥中,卻會(huì)出現(xiàn)為數(shù)眾多的高溫微生物.氧氣充足的土層中按理只適合于好氧菌生長(zhǎng),實(shí)際上也有一些嫌氣菌生活,原因是好氣菌生長(zhǎng)繁殖消耗了土層中大量氧氣,為嫌氣菌創(chuàng)造了局部生長(zhǎng)的有利環(huán)境,故一般土壤中也能分離到嫌氣菌.

    海洋對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)是一個(gè)特殊的局部環(huán)境,盡管許多微生物也是經(jīng)河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來(lái),但由于海洋獨(dú)特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件,使海洋微生物具備特殊的生理活性,相應(yīng)也產(chǎn)生了一些不同于陸地來(lái)源的特殊產(chǎn)物.前蘇聯(lián)學(xué)者發(fā)現(xiàn),20%～50%的海鞘、海參體內(nèi)的微生物可產(chǎn)生具有細(xì)菌毒性和殺菌活性的化合物.此外,美國(guó)馬里蘭大學(xué)也曾從海綿體內(nèi)的共生或共棲的細(xì)菌中分離到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物質(zhì).日本發(fā)現(xiàn)深海魚(yú)類(lèi)腸道內(nèi)的嗜壓古細(xì)菌,80%以上的菌株可以生產(chǎn)EPA 和DHA,最高產(chǎn)量可達(dá)36%和24%.筆者從鱈魚(yú)腸道中分離到一株pj20細(xì)菌,產(chǎn)EPA14.78mg/L,在15℃培養(yǎng)時(shí)EPA占脂肪酸的 12.7%.日本也從海洋Thraustochvtrium aureum中篩選到一株產(chǎn)DNA達(dá)290mg/L的菌株.從海洋中采樣時(shí),可參考其中不同種類(lèi)微生物的分布規(guī)律:表層多為好氣異養(yǎng)菌,底層由于有機(jī)質(zhì)豐富,硫化氫含量高,厭氣性腐敗菌和硫酸鹽還原菌較多,兩層中則多為紫硫菌.

    具有特殊性質(zhì)的微生物通常分布在一些特殊的環(huán)境中.如得克薩斯州中南部的一個(gè)巖洞中存在著大量嗜堿性的,能進(jìn)行氨氧化和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物,其原因是這里生活這2000萬(wàn)只蝙蝠,它們每晚吃釣5萬(wàn)lb(磅)昆蟲(chóng),其排泄物造成了洞內(nèi)0m深的豐富營(yíng)養(yǎng)層,這種特殊的環(huán)境對(duì)該種微生物起了選擇和富集的作用.還有人從侵蝕木船的一種蠕蟲(chóng)腸道中分離到既能固氮又能降解纖維素的微生物.從考拉(Koala)熊腸中也曾分離到萜烯分解酶的產(chǎn)生菌,這可能因?yàn)榭祭瓕?zhuān)吃含有高萜烯的桉樹(shù)類(lèi)植物,給該種微生物創(chuàng)造了一個(gè)適宜的生長(zhǎng)環(huán)境.美國(guó)從用硝酸處理過(guò)的花生殼中分離到一株節(jié)桿菌,該菌以木質(zhì)素為唯一碳源,它對(duì)處理過(guò)的花生殼的消化率可達(dá)到63%,再加入釀酒酵母使其蛋白質(zhì)含量達(dá)到13.6%,可作為牛、豬、雞飼料的添加劑.

2. 極端環(huán)境條件的影響

    微生物一般在中溫、中性pH條件下生長(zhǎng).但在絕大多數(shù)微生物所不能生長(zhǎng)的高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽或高輻射強(qiáng)度的環(huán)境下,也有少數(shù)微生物存在,這類(lèi)微生物被稱(chēng)為極端微生物.生活所處的特殊環(huán)境,導(dǎo)致它們具有不同與一般微生物的遺傳特性、特殊結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能,因而在冶金、采礦及生產(chǎn)特殊酶制劑方面有著巨大的應(yīng)用價(jià)值.

    嗜冷菌(thermophiles)的最適生長(zhǎng)溫度為15℃,在0℃也可生長(zhǎng)繁殖,最高溫度不超過(guò)20℃.主要分布于寒冷的環(huán)境中,如南北兩極地區(qū)、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環(huán)境中.這類(lèi)微生物在低溫發(fā)酵時(shí)可生產(chǎn)許多風(fēng)味食品且可節(jié)約能源及減少中溫菌的污染.最適生長(zhǎng)pH在8.0以上,通常在 pH9～10之間的微生物,稱(chēng)之為嗜堿菌(alkaliphiles).大量不同類(lèi)型的嗜堿菌已經(jīng)從土壤、堿湖、堿性泉甚至海洋中分離得到.由于大部分堿湖伴有高鹽,許多嗜堿菌同時(shí)也是嗜鹽菌.該類(lèi)菌所產(chǎn)生的酶如耐堿蛋白酶和堿性纖維素酶可作為洗滌劑的舔加成分,也可將堿性淀粉酶用于紡織品工業(yè).嗜堿菌中的基因還可以用來(lái)調(diào)節(jié)其他細(xì)菌中基因產(chǎn)物的表達(dá)和分泌.嗜熱微生物是嗜熱菌最好的來(lái)源.有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌.從意大利境內(nèi)的噴硫磺氣的火山口中分離到一種原始的微生物,在pH2和90℃時(shí)生長(zhǎng)最好,其代謝類(lèi)型極不尋常,既能作為耗氧型自養(yǎng)菌將硫氧化成硫酸,使自己增殖,又能作為厭氧菌用氫還原硫,生成H2S.