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一、目的要求:
了解原生質體融合技術的原理.
學習并掌握以細菌為材料的原生質體融合技術.
二、基本原理:
原核微生物基因重組主要可通過轉化、轉導、接合等途徑,但有些微生物不適于采用這些途徑,從而使育種工作受到一定的限制.1978 年第三屆國際工業微生物遺傳學討論會上,有人提出微生物細胞原生質體融合這一新的基因重組手段.由于它具有許多特殊優點,所以,目前已為國內外微生物育種工作所廣泛研究和應用.
(一) 原生質體融合的優點:
1、克服種屬間雜交的“不育性”,可以進行遠緣雜交.由于用酶解除去細胞壁,因此,即使相同接合型的真菌或不同種屬間的微生物,皆可發生原生質體融合,產生重組子.
2、基因重組頻率高,重組類型多.原生質體融合時,由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用,使細胞相互聚集,可以提高基因重組率.原生質體融合后,兩個親株的整套基因組 (包括細胞核、細胞質)相互接觸,發生多位點的交換,從而產生各種各樣的基因組合,獲得多種類型的重組子.
3、可將由其他育種方法獲得的優良性狀,經原生質體融合而組合到一個菌株中.
4、存在著兩個以上親株同時參與融合,可形成多種性狀的融合子.
(二) 原生質體融合步驟:
1、選擇親本:選擇兩個具有育種價值并帶有選擇性遺傳標記的菌株作為親本.
2、制備原生質體:經溶菌酶除去細胞壁,釋放出原生質體,并置高滲液中維持其穩定.
3、促融合:聚乙二醇加入到原生質體以促進融合.聚乙二醇為一種表面活性劑,能強制性的促進原生質體融合.在有Ca2+ 、Mg2+離子存在時,更能促進融合.
4、原生質體再生:原生質體已失去細胞壁,雖有生物活性,但在普通培養基上不生長,必須涂布在再生培養基上,使之再生.
5、檢出融合子:利用選擇培養基上的遺傳標記,確定是否為融合子.
6、融合子篩選:產生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類型,前者性能不穩定,要選出性能穩定的單倍重組體,反復篩選出生產性能良好的融合子.
(三) 原生質體再生率和融合率計算
三、實驗材料:
(一) 菌種:
枯草芽孢桿菌T4412 ade- his-、枯草芽孢桿菌TT2 ade-pro-
(二) 培養基(見附錄):
1、完全培養基(CM,液體);
2、完全培養基(CM,固體) 液體培養基中加入2.0%瓊脂;
3、基本培養基(MM);
4、補充基本培養基(SM) 在基本培養基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的純化瓊脂,75 Pa 滅菌20min;
5、再生補充基本培養基(SMR) 在補充基本培養基中加入0.5 mol/L 蔗糖,1.0％純化瓊脂作上層平板,2.0％純化瓊脂作底層平板、75 Pa 滅菌20 min.
6、酪蛋白培養基(測蛋白酶活性用).
(三) 緩沖液:
1、0.1mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液.
2、高滲緩沖液:于上述緩沖液中加入0.8 mol/L 甘露醇.
(四) 原生質體穩定液(SMM):
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 順丁烯二酸,調pH 6.5.
(五) 促融合劑:
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液.
(六) 溶菌酶液:
酶粉酶活為4000 u/g,用SMM 溶液配制,終濃度為2 mg/mL,過濾除菌備用.
(七)器皿:
培養皿、移液管、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、臺式離心機、721 比色計、細菌過濾器.
四、實驗內容:
(一) 原生質體的制備:
1、培養枯草芽孢桿菌:
取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環到裝有液體完全培養基(CM)的試管中,36℃振蕩培養14 h,各取1 mL 菌液轉接入裝有20 mL 液體完全培養基的250 mL 錐形瓶中,36℃振蕩培養 3 h,使細胞生長進入對數前期,各加入25 u/mL 青霉素,使其終濃度為0.3 u/mL,繼續振蕩培養2 h.
2、收集細胞:
各取菌液10 mL,4000 r/min 離心10 min,棄上清液,將菌體懸浮于磷酸緩沖液中,離心.如此洗滌兩次,將菌體懸浮10 mL SMM 中,每mL 約含108～109 活菌為宜.
3、總菌數測定:
各取菌液0.5 mL,用生理鹽水稀釋,取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀釋度作兩個平板)、傾注完全培養基,36℃培養24 h 后計數.此為未經酶處理的總菌數.
4、脫壁:
二株親本菌株各取5 mL 菌懸液,加入5 mL 溶菌酶溶液,溶菌酶濃度為100 ug/mL,混勻后于36℃水浴保溫處理30 min,定時取樣,鏡檢觀察原生質體形成情況,當95%以上細胞變成球狀原生質體時,用4000 r/min 離心10 min,棄上清液,用高滲緩沖液洗滌除酶,然后將原生質體懸浮于5 mL 高滲緩沖液中.立即進行剩余菌數的測定.
5、剩余菌數測定:
取0.5 mL 上述原生質體懸液,用無菌水稀釋,使原生質體裂解死亡,取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL,涂布于完全培養基平板上,36℃培養24～48 h,生長出的菌落應是未被酶裂解的剩余細胞.
計算酶處理后剩余細胞數,并分別計算二親株的原生質體形成率.原生質體形成率＝未經酶處理的總菌數一酶處理后剩余細胞數
(二) 原生質體再生:
用雙層培養法,先倒再生補充基本固體培養基(SMR)作底層,取0.5 mL 原生質體懸液,用SMM作適當稀釋,取10-3、10-4、10-5 稀釋液各1mL,加入底層平板培養基的中央,再倒入上層再生補充半固體培養基混勻,36℃培養48 h.分別計算二親株的原生質體的再生率,并計算其平均數.
(三) 原生質體融合:
取兩個親本的原生質體懸液各1 mL 混合,放置5 min 后,2500 r/min 離心10 min,棄上清液.于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混勻,再加入1.8 mL PEG 溶液,輕輕搖勻,置36℃水浴保溫處理2 min,2500 r/min 離心10 min,收集菌體,將沉淀充分懸浮于2 mL SMM 液中.
(四) 檢出融合子:
取0.5 mL 融合液,用SMM 液作適當稀釋,取0.1 mL 菌液與滅菌并冷卻至50℃的再生補充基本培養基軟瓊脂中混勻,迅速傾入底層為再生補充基本培養基的平板上,36℃培養2 d,撿出融合子,轉接傳代,并進行計數,計算融合率.
(五) 融合子的篩選:
挑選遺傳標記穩定的融合子,凡是在再生補充基本培養基平板上長出的菌落,初步認為是融合子,可接入到酪蛋白培養基平板上,再挑選蛋白酶活性高于親本的融合 子.由于原生質體融合后會出現兩種情況:一種是真正的融合,即產生雜核二倍體或單倍重組體,另一種只發生質配,而無核配,形成異核體.兩者都能在再生基本 培養基平板上形成菌落,但前者穩定,而后者則不穩定.故在傳代中將會分離為親本類型.所以要獲得真正融合子,必須進行幾代的分離、純化和選擇.
附錄 細菌原生質體融合試驗用培養基
1、完全培養基(CM):
蛋白胨 1 g
葡萄糖 1 g
酵母粉 0.5 g
牛肉膏 0.5 g
NaCl 0.5 g
蒸餾水 100 mL
pH 7.2
100 Pa 滅菌20 min.
如需配制固體完全培養基時,則需在上述液體培養基中加入2％瓊脂.
2、基本培養基(MM):
葡萄糖 0.5 g
(NH4)2SO4 0.2 g
檸檬酸鈉 0.1 g
K2HPO4·3H2O 1.4 g
KH2PO4 0.6 g
MgSO4·7H2O 0.02 g
蒸餾水 100 mL
純化瓊脂 2 g
pH 7.0
100 Pa 滅菌20 min.
3、高滲再生培養基(CMR):
蛋白胨 1 g
葡萄糖 0.5 g
酵母粉 0.5 g
牛肉膏 0.5 g
NaCl 0.5 g
蔗糖 0.5 mol/L
MgCl2 20 mmol/L
純化瓊脂 2 g
pH 7.0
100 Pa 滅菌20 min.
如配上層固體培養基,需在上述液體培養基中加入0.6％瓊脂.如需配底層固體培養基,則需加入2％瓊脂.
4、補充基本培養基(SM):
在基本培養基中加入20 ug/mL 腺漂吟及2％純化瓊脂.
70Pa 滅菌20 mm.
5、再生補充基本培養基(SMR):
在補充基本培養基中加入0.5 mol/L 蔗糖及2％純化瓊脂.
70 Pa 滅菌 20 min.
6、酪蛋白培養基(測蛋白酶活性用):
Na2HPO4·12H2O 0.13 g
KH2PO4 0.036 g
NaCl 0.01 g
ZnSO4·7H2O 0.002 g
CaCl2·2H2O 0.0002 g
酪素 0.4 g
酪素水解氨基酸 0.005 g
瓊脂 1.5～2 g
蒸餾水 100 mL
pH 7.2
100 Pa 滅菌20 min.
7、0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0、pH 7.0):
K2HPO4 相對分子質量＝174.18,0.1 mol/L 溶液為17.4g/L,稱取17.4 g K2HPO4,溶解于蒸餾水中,定容至1000 mL.
KH2PO4 相對分子質量＝136.09,0.1 mool/L 溶液為13.6 g,稱取13.6 g KH2PO4, 溶解于蒸餾水中,定容至1000mL.
蒸餾水 100 mL
