一、培養(yǎng)基制備規(guī)程

1.目的

規(guī)范本中心微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備工作，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。

2.適用范圍

本規(guī)程適用于使用商品化干粉培養(yǎng)基制備各種待用培養(yǎng)基。

3.職責(zé)

3.1 培養(yǎng)基制備人員負(fù)責(zé)按本規(guī)程制備各類(lèi)培養(yǎng)基，及時(shí)填寫(xiě)成品培養(yǎng)基制備記錄，編制培養(yǎng)基目錄，粘貼標(biāo)簽。

3.2 科室負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)指導(dǎo)、監(jiān)督檢驗(yàn)人員按規(guī)程制備培養(yǎng)基。

4.制備程序

4.1 概述

4.1.1 制備培養(yǎng)基所用的化學(xué)藥品，均為化學(xué)純。有些試劑在使用前應(yīng)先試用。

4.1.2 使用脫水培養(yǎng)基和其他含有有害物質(zhì)（如膽鹽或其他選擇劑）的成分時(shí)，應(yīng)遵循良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說(shuō)明。

4.1.3 使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說(shuō)明配制。如質(zhì)量/體積、PH、制備條件、滅菌條件和操作步驟等。

4.1.4 使用各別成分制備培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)按配方準(zhǔn)確配制，并記錄所使用成分的特性。

4.1.5 制備培養(yǎng)基常用的容器為玻璃、不銹鋼鋁、鍋或搪瓷容器。不宜使用銅或鐵鍋。培養(yǎng)基中的含銅量過(guò)高時(shí)（＞0.3mg/1000ml），細(xì)菌不易生長(zhǎng)；含鐵量過(guò)高時(shí)（＞0.14mg/1000ml），則妨礙細(xì)菌毒素的產(chǎn)生。

4.2 水

4.2.1 制備培養(yǎng)基應(yīng)使用蒸餾水或相同質(zhì)量的水，以排除測(cè)試條件下抑制或影響微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)。電阻率在25℃時(shí)應(yīng)≥300000Ω·cm。最好每周檢測(cè)一次。

4.2.2 制備培養(yǎng)基時(shí)避免采用離子交換器生產(chǎn)的去離子水，其微生物含量可能較高，這種水在過(guò)濾滅菌后仍可能帶有細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制因子。

4.3 稱(chēng)量和復(fù)水

4.3.1 稱(chēng)量所需量的脫水培養(yǎng)基（注意緩慢操作，必要時(shí)佩戴口罩或在通風(fēng)柜中操作，以防吸入含有有毒物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊），然后再加水至所需的量。

4.3.2 必須選擇合適的天平和量筒，以確保稱(chēng)量和移液的準(zhǔn)確性。

4.4 溶解和分裝

脫水培養(yǎng)基加水后應(yīng)適當(dāng)加熱，并不停攪拌使其快速溶解，必要時(shí)，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱前應(yīng)先浸泡幾分鐘。用各別成分制備的培養(yǎng)基應(yīng)將不同成分分別加入適量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。

4.5  測(cè)定和調(diào)整PH

4.5.1 用PH計(jì)或精密PH紙測(cè)pH，必要時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

4.5.2 在實(shí)驗(yàn)室用各別成分制備的培養(yǎng)基，除特殊說(shuō)明外，培養(yǎng)基滅菌后冷卻至25℃時(shí)，PH的變化不應(yīng)超過(guò)0.2個(gè)單位。

4.5.3 一般使用濃度約為40g/L(約1mol/L)的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH。

4.6 分裝

將配制好的培養(yǎng)基根據(jù)使用要求分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦校�并及時(shí)密封好。

4.7 滅菌

4.7.1分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)天進(jìn)行滅菌處理（2小時(shí)內(nèi)滅菌最佳）。

4.7.2實(shí)驗(yàn)室采用濕熱滅菌對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，按照培養(yǎng)基使用說(shuō)明采用合適的滅菌溫度和時(shí)間。

4.8 保存

制就的培養(yǎng)基不宜保存過(guò)長(zhǎng)，以少量勤做為宜。培養(yǎng)基存放于暗處和（或）4℃～12℃冰箱的密封袋或平皿筒中可延長(zhǎng)貯存期限。

4.9 制備記錄

培養(yǎng)基制備完畢后，應(yīng)及時(shí)填寫(xiě)“成品培養(yǎng)基制備記錄”和“成品培養(yǎng)基目錄清單”，并在外包裝上貼好相應(yīng)的標(biāo)簽，標(biāo)明名稱(chēng)，編號(hào)，制備日期和有效期等內(nèi)容。

二、培養(yǎng)基使用規(guī)程

1. 目的

規(guī)范本中心微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基的使用和管理。

2. 適用范圍

本規(guī)程適用于培養(yǎng)基的儲(chǔ)存、融化和廢棄等。

3. 職責(zé)

3.1 檢驗(yàn)人員：按照本規(guī)程規(guī)范使用培養(yǎng)基、定期檢查培養(yǎng)基是否失效。

3.2 科室負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)指導(dǎo)、監(jiān)督檢驗(yàn)人員規(guī)范使用培養(yǎng)基。

4.使用程序

4.1 培養(yǎng)基的儲(chǔ)存

4.1.1 除特殊說(shuō)明和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，通常情況下基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）應(yīng)在4℃冰箱中保存不超過(guò)3個(gè)月，或在室溫（20℃）下保存不超過(guò)一個(gè)月。

4.1.2 滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)置適當(dāng)條件下保存至規(guī)定的有效期，并對(duì)保存條件進(jìn)行確證,詳見(jiàn)表1。

                                       表1  培養(yǎng)基2～8℃條件保存期限

4.2 瓊脂培養(yǎng)基的融化

4.2.1 將培養(yǎng)基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法（如高壓鍋中的蒸汽，如100℃）使之融化。經(jīng)過(guò)高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重加熱時(shí)間，避免過(guò)度加熱。

4.2.2 培養(yǎng)基融化后放入47℃±2℃的恒溫水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中保溫，直至使用。

4.2.3 融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時(shí)間一般不應(yīng)超過(guò)4h，不可二次融化。

4.3 培養(yǎng)基的脫氣

必要時(shí)，將培養(yǎng)基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min，加熱時(shí)松開(kāi)容器的蓋子；加熱后蓋緊，并迅速冷卻至使用溫度。

4.4 添加成分的加入

對(duì)熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃±2℃時(shí)再加入。滅菌的添加成分在加入之前，應(yīng)先放置到室溫，避免冷的液體造成瓊脂凝結(jié)或形成片狀物。將加入添加成分的培養(yǎng)基緩慢充分混勻，盡快分裝到待用的容器中。

4.5 平板的制備和儲(chǔ)存

4.5.1 傾注融化的培養(yǎng)基到平皿中，使之在平皿中形成一個(gè)至少2mm厚的瓊脂層（直徑90mm的平皿通常要加入15mL瓊脂培養(yǎng)基）。將平皿蓋好皿蓋后放到水平平面使瓊脂冷卻凝固。

4.5.2 為了避免產(chǎn)生冷凝水，平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中。貯存前不要對(duì)培養(yǎng)基表面進(jìn)行干燥處理。

4.5.3 凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或放于暗處和（或）4℃～12℃冰箱中，儲(chǔ)存期限見(jiàn)“4.1培養(yǎng)基的儲(chǔ)存”。 并在外包裝上貼好相應(yīng)的標(biāo)簽，標(biāo)明名稱(chēng)，編號(hào)，制備日期和有效期等內(nèi)容。

4.5.4 對(duì)于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基。應(yīng)先對(duì)瓊脂表面進(jìn)行干燥：揭開(kāi)平皿蓋，將平板倒扣于烘箱/培養(yǎng)箱中（溫度設(shè)為25℃～50℃）；或放在有對(duì)流風(fēng)的無(wú)菌凈化臺(tái)中，直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過(guò)度干燥。商業(yè)化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說(shuō)明使用。

4.6 培養(yǎng)

4.6.1 培養(yǎng)時(shí)每垛最多堆放六個(gè)平板，平板間要留有空隙以保證空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達(dá)到一致。

4.6.2 在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基會(huì)損失水分。當(dāng)水分損失的量大于培養(yǎng)基總量的15%時(shí)，就會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)。造成培養(yǎng)基水分損失的因素較多，如培養(yǎng)基成分，平皿中培養(yǎng)基總量和培養(yǎng)箱的類(lèi)型等（如使用帶風(fēng)扇的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱中的濕度偏低，平板在培養(yǎng)箱中位置靠近培養(yǎng)箱內(nèi)壁等），操作時(shí)應(yīng)注意避免。

4.7 培養(yǎng)基的棄置

培養(yǎng)基廢棄前，實(shí)驗(yàn)室采用121℃、15分鐘蒸汽滅菌，或煮沸消毒30分鐘。