1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株概念

GB/T 27405-2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測：

1、標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物：標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株和工作菌株的統(tǒng)稱。

2、標(biāo)準(zhǔn)菌株：至少定義至屬或種水平的菌株。按其特征進(jìn)行分類和描述，有明確的來源。

3、標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株：標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過一代轉(zhuǎn)接后獲得的同種菌株。

4、工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲備轉(zhuǎn)接后獲得的同種菌株。

1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用：

各種國際標(biāo)準(zhǔn)、國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)微生物檢測，用于驗收培養(yǎng)基(包括試劑盒)、驗證方法和評估實驗操作。

2.1菌株的采集：

實驗室用菌種一是到國家法定機構(gòu)采購，二是購買ATCC菌種，三是科研中菌種交流。不管是哪種來源，均統(tǒng)一采集。采集中嚴(yán)格按照規(guī)范執(zhí)行。要求包裝可靠，采集迅速，不泄©不污染。保證菌種合格和環(huán)境安全。采集中要有菌種傳代標(biāo)識。選擇有資質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的合格供應(yīng)商，ÿ批標(biāo)準(zhǔn)菌株必須附帶有供應(yīng)商的合格證或檢測報告或說明書，來證明所采購的標(biāo)準(zhǔn)菌株是合格的。

2.2標(biāo)準(zhǔn)菌株和驗收：

實驗室收到標(biāo)準(zhǔn)菌株，首先應(yīng)進(jìn)行符合性感官檢查，記¼菌株號和標(biāo)準(zhǔn)菌株來源途徑信息，確保溯源性清楚。同時還應(yīng)記¼標(biāo)準(zhǔn)菌株名稱和數(shù)量、生產(chǎn)日期、接收日期和有無破損等情況。

2.3凍干標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活：

2..3.1開啟產(chǎn)品包裝：先用70%酒精棉擦拭外包裝，從凹口處撕開產(chǎn)品外包裝，撕掉標(biāo)簽上的拉片，將其貼于菌株接收、保存記¼序號前面。

2.3.2復(fù)活：選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（根據(jù)生產(chǎn)商說明或有關(guān)技術(shù)通則見附¼）進(jìn)行復(fù)活。菌種的首次活化最好是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，除非特殊情況或特別推薦，一般不用液體培養(yǎng)基。凍干菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，從標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏中心購買的凍干標(biāo)準(zhǔn)菌株為第F0代。捏管ñ處安瓿瓶（僅一次）使其釋放水合液體。垂直握住安瓿瓶并輕拍之，使液體流入含小球的管底。通過擠捏壓碎小球使其與液體混合，立即將拭子浸于水合液體。擠壓并旋轉(zhuǎn)拭子，接種于初級培養(yǎng)平板，接種圈的直徑約為25mm，用一無菌接種環(huán)在先前接種區(qū)域劃線10-20次，促使分離出單菌落。同時吸出部分菌液接種胰蛋白胨大豆肉湯管，副溶血性弧菌接種3%氯化鈉菌胰蛋白胨大豆肉湯管。將接種好的平板和管立即進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)溫度通常為25℃或37℃。多數(shù)凍干菌株會在幾天后長出，但是少數(shù)菌會表現(xiàn)出延滯期延長的現(xiàn)象，需要將正常培養(yǎng)時間加倍。復(fù)活后的菌株為F1代。

附¼

2.3.3：將TSB生長的濃菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混勻后將液體吸出，將保藏管-18℃保存1-3年為標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株F2代。將平板上生長的良好菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面（副溶血性弧菌用3%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂）36℃培養(yǎng)24h當(dāng)作工作菌株，記¼為F3代。

2.4工作菌株確認(rèn)方法及依據(jù)：

用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板（營養(yǎng)瓊脂、大豆胰蛋白胨瓊脂）上或相應(yīng)的細(xì)菌鑒別平板（如伊紅美藍(lán)、麥康凱、BP等上劃線分離單個菌落，置適宜條件下培養(yǎng)（若該類微生物為厭氧菌，則培養(yǎng)條件應(yīng)為厭氧條件）以同樣方法取真菌和酵母菌至SDA（薩布羅培養(yǎng)基）平板上或õ瑰紅鈉培養(yǎng)基平板上，23～28℃下培養(yǎng)7d；培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落狀態(tài)，然后挑取單一純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特征及菌體形態(tài)以確定菌種。

2.5 污染處理：

假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純。要將該污染培養(yǎng)物做滅菌處理，尋找原因，重新分離挑選純菌落。

2.6菌種保存：

所有菌種均由實驗室專人(雙人雙鎖)保存于專用冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺帳，詳細(xì)記¼菌種采集、保管、制備、使用、處置情況；ÿ一種菌種一定要有檢測鑒定報告（具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法）；具體菌種保存方法一般為：

將復(fù)蘇后肉湯與滅菌甘油按15%甘油比例（肉湯8.5mL+甘油1.5mL）混合，-30 ℃凍存，（可用2mL凍存管凍存多管），作為保藏儲備菌株F1代，也可使用商品化的菌種保存管。

2.7菌種的傳代：

2.7.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇：

① 菌種操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，防止雜菌污染。

② ÿ次使用和復(fù)蘇時只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養(yǎng)。

2.7.2標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株ÿ轉(zhuǎn)接一次須進(jìn)行確認(rèn)。（確認(rèn)方法一般為他們各自獨有的形態(tài)，在鑒別培養(yǎng)基上的形態(tài)）

2.7.3工作菌株轉(zhuǎn)接的方法：

①配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（溶血性弧菌加3%氯化鈉 ），121℃高壓滅菌15分鐘后分裝在試管內(nèi)，冷卻后備用。

②在無菌條件下，用接種環(huán)挑取菌苔至新鮮試管上作“米”字形劃線接種，放置在36℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時。

2.7.4工作菌株的使用：

2.7.4.1內(nèi)部質(zhì)量控制：一個月一次陽性對照、培養(yǎng)基ÿ批驗收；

2.7.4.2外部質(zhì)量控制：能力驗證、實驗室比對；

2.7.5工作菌株的期間核查：

2.7.5.1期間核查的頻率：ÿ半年對使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行一次期間核查。

2.7.5.2工作菌株期間核查的方法及依據(jù)：同工作菌株的確認(rèn)一樣。

2.7.5.3建立標(biāo)準(zhǔn)菌株期間核查記¼。

2.8菌種的標(biāo)識和使用期限：
2.8.1標(biāo)識：菌種代數(shù)的計算為干粉菌種為第0代，轉(zhuǎn)接一次加一代。

具體標(biāo)識為：例單增李斯特氏菌第0代，標(biāo)識為DZ-0，第一代標(biāo)識為DZ-01第一代有12支，則DZ-01-01、……、DZ-01-12；并標(biāo)明日期：如2017.02.13這樣填寫。

2.9 菌種的保藏：

2.9.1將試管內(nèi)菌種放入冰箱中2～8℃冷藏保存。

2.9.2將傳代并經(jīng)過培養(yǎng)后的菌種放入冰箱中2～8℃保存。

ÿ支保存菌種需標(biāo)明菌名、標(biāo)準(zhǔn)編號、傳次、傳代日期。

2.10菌種的銷毀：

2.10.1菌種使用后或超過貯存期的應(yīng)進(jìn)行銷毀。

2.10.2需銷毀的菌種，應(yīng)用高壓蒸汽（121℃）滅菌30分鐘。

2.10.3滅菌后，再進(jìn)行清洗和處理。

 2.10.4銷毀的菌種應(yīng)做好記¼。銷毀時由化驗負(fù)責(zé)人監(jiān)督銷毀，保管人員負(fù)責(zé)銷毀。

1.斜面低溫保存法

將分純的待存菌接種于適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，得到充分生長后，用封口膜封口，貼上標(biāo)簽，保存于4℃的冰箱中。此法操作簡單、使用方便、不需要特殊設(shè)備，是實驗室菌種保存最常用的方法。但保存時間短，一般ÿ個月都要移

種1次，而且菌種容易變異，所以此方法只適合實驗室短期實驗菌株的保存。

2.半固體瓊脂法 

用接種針將以分純的待存菌，穿刺接種于半固體中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)后出，封上無菌的液體石蠟，貼上標(biāo)簽，放4℃冰箱保存。此方法簡便易操作，不需特殊設(shè)備、技術(shù)難度不大，但保存的時間不長，一般只能保存1年以內(nèi)，而且對抵抗力弱以及一些特殊菌種大概只能存活3～6個月，需要頻繁的傳代，這樣很容易使菌株受到污染、變異。所以此方法不適用菌種的長期保存，只適合實驗室一些要求不高的菌種的短期保存。

3.液體石蠟保存法 

將液體石蠟滅菌，放于37℃恒溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉備用。再將已分純的待存菌在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體，用無菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟，注入已長好的斜面培養(yǎng)基上，用量以高出斜面1cm為準(zhǔn)，將試管直立，

貼上標(biāo)簽，置4℃下保存。此法制作簡單，不需要特殊設(shè)備，菌種可以保存1年左右不需要經(jīng)常移種，缺點是保存的時候需要直立放置。此方法適合實驗室短期保存，而且保存時需要一定的空間。

4.高層半固體瓊脂石蠟保存法

將待存菌經(jīng)平板劃線分離后，挑單個菌落用接種針反復(fù)穿刺接種到高固體瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)后取出，用滅菌過的液體石蠟滴加到半固體瓊菌種管表層約0.5cm高度，貼上標(biāo)簽，存放4℃冰箱。此法操作簡便，不需要特殊設(shè)備，效果好，可以保存菌株1～2年。所以適合實驗室菌株的較長期的保存。

5.紙片法 

將已分純的待存菌用無菌鑷子鑷取紙片，在紙片上刮取4～5個菌落，入凍存管內(nèi)，蓋上蓋子后用封口膠布封住邊緣，貼上標(biāo)簽，放入冰箱冷凍保存(－20℃左右)。此方法具有操作簡單、不需特殊設(shè)備、經(jīng)濟實用、保存空間小等而且保存時間至少2年，但對一些營養(yǎng)要求比較高的菌種，存活率不理想。所以方法適合實驗室一些營養(yǎng)要求不高的菌種較長時間的保存。

6.甘油液保存法

將已分純的待存菌接種于肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24h，然后按5份肉湯溶液、2份甘油－生理鹽水保存液的比例分裝于滅菌的微量離心管或細(xì)胞凍存管中，貼上標(biāo)簽，置－80℃～－20℃冰箱保存。此法操作簡便，不需要特殊設(shè)備，效果好，可以保存菌種3年左右，無變異現(xiàn)象，而且此方法還可以保存一些要求較高的特殊菌種，適用范Χ廣。所以此方法適合實驗室普通菌種或特殊菌種的較長期的保存。