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我的試驗(yàn)咋û出結(jié)果呢？
明明……為什ô會(huì)是這樣？
……
作為實(shí)驗(yàn)室的科研狗
那些絕望的咆哮
現(xiàn)在有û有在耳邊響起……
其實(shí)，仔細(xì)查找原因，
往往是由于操作上面的不認(rèn)真，
或一些忽略的小細(xì)節(jié)
小編收集了各·實(shí)驗(yàn)小白到大神的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)血淚史
和大家分享：
1.跑page膠的時(shí)候
小電壓跑會(huì)避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會(huì)比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。
2.提取質(zhì)粒的時(shí)候
最后一步的酒精揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的ø切反應(yīng)的決定性因素。所以這一步盡量揮發(fā)長(zhǎng)一點(diǎn)時(shí)間，最好是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是37度溫箱放長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間，我試過(guò)室溫過(guò)夜，ø切很好。
3.做WESTERN BLOT 的時(shí)候
大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度，封閉時(shí)間，曝光時(shí)間等等，而ÿ次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)完全û有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來(lái)，用的時(shí)候取出一塊，û有任何影響。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來(lái)說(shuō)，節(jié)約了大量的時(shí)間。
4.有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置
1)將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲(chǔ)存，需要的時(shí)候只需將相應(yīng)的母液混合，補(bǔ)加水稀釋即可。
2)配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量，如配LB時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是5g，哪個(gè)要10個(gè)，因此可以在常用的試劑瓶的標(biāo)簽上注明所需的量，如配LB時(shí)，在NaCl瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L等，很方便，不需要ÿ次配之前臨時(shí)翻書。
5.有關(guān)PCR主反應(yīng)液配置
在做克¡鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在ø切鑒定前進(jìn)行PCR鑒定，ÿ次配置PCR反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100倍配置100×主反應(yīng)液(100次反應(yīng))，其中含buffer，Mg2+，dNTPs，但不含引物和Taqø，然后可以10×分裝或一管儲(chǔ)存在-20度，在需要的時(shí)候拿出融開，然后按所需的PCR反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：
1)可極大的節(jié)省寶貴的時(shí)間，可早點(diǎn)收工，看球；
2)避免ÿ次反應(yīng)加樣不均的可能；
3)大大減少PCR假陽(yáng)性的產(chǎn)生。
6.有關(guān)ø切反應(yīng)液的配置
在做ø切時(shí)，也可以象PCR一樣配置主反應(yīng)液，ÿ次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入buffer、ø、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒DNA的體積分裝，然后再在ÿ管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒DNAø切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時(shí)有10幾個(gè)陽(yáng)性克¡需要鑒定時(shí)尤為明顯：
1)各反應(yīng)成分均一；
2)可大大減少限制型內(nèi)切ø的使用；
3)節(jié)省時(shí)間。
7.有關(guān)SDS－PAGE：
1)可將SDS-PAGE的積層膠，分離膠預(yù)先配好大體積如100ml儲(chǔ)存在4度冰箱(注：10%AP，TEMED不加，切記!!!)，ÿ次配置時(shí)只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入AP，TEMED即可，û必要ÿ次制膠時(shí)候翻分子克¡，特別方便，而且，這樣的預(yù)制膠可儲(chǔ)存半年以上，不失為偷懶的絕佳方法;更關(guān)鍵的是可大大減少與丙稀酰胺的接觸，因此大大減少中毒的機(jī)會(huì)。
2)電泳時(shí)雖然小電泳分離效果要好一些，但2小時(shí)以上的等待的時(shí)間實(shí)在是痛苦，因此可以提高電泳至150V，但需要將整個(gè)電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱，這樣跑出來(lái)的膠分離效果絲毫不比低電壓來(lái)的差，關(guān)鍵是時(shí)間大大節(jié)省，不需1h即可看結(jié)果了。
8.實(shí)驗(yàn)中小竅門
能夠分成兩類：一類是“非常規(guī)”操作;一類是常規(guī)操作過(guò)程中一些省時(shí)省事手段。
前一類，舉個(gè)例子：有時(shí)候第一天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長(zhǎng)成的菌落比較大(1~2毫米以上，BL21就長(zhǎng)得快)，下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個(gè)情況下可以直接挑取一塊菌苔(勿帶出培養(yǎng)基)，50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)粒可以直接用于電泳和ø切。這樣操作，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省6~8小時(shí)的時(shí)間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和ø切的效果，不同的實(shí)驗(yàn)室或者操作者δ必能夠很方便地重復(fù)----其實(shí)，其它的一些“小竅門”也是如此。
后一類的小竅門則在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)處不在。
如：平行作不同樣本的PCR,模板DNA加量一樣，配置PCR體系可以一起配制后分裝----這點(diǎn)做過(guò)試驗(yàn)的都知道，但是配制的時(shí)候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點(diǎn)(如用100微升則配110微升)，這樣可以避免有時(shí)候分裝不夠的尷尬，因?yàn)椴煌貏e是大小不同的槍，會(huì)有誤差。再比如：sds-page膠預(yù)配(APS和TEMED、或者后者先不加)的問(wèn)題，實(shí)際上時(shí)間放置過(guò)長(zhǎng)肯定影響效果，如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板，何嘗不可?又比如，配sds-page膠的時(shí)候，上層膠和下層膠可以只用一個(gè)大槍頭：先取膠，次取水，取6.8的tris后再取8.8的tris，省時(shí)省料。
但我想，“竅門”和“偷懶”不應(yīng)該是因果關(guān)系。其實(shí)，不管是那一類的小竅門，都是在充分地理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理、經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)積累、再加上一點(diǎn)點(diǎn)思索然后嘗試的結(jié)果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否則，別人的小竅門對(duì)你也δ必能夠有用。才進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新手，務(wù)必要先練好規(guī)范扎實(shí)的操作，然后才能弄“竅門”。本末倒置，貽害無(wú)窮。
9.SDS －PAGE的積層膠
分離膠預(yù)先配成mixture，APS制膠時(shí)加入，半年內(nèi)使用，絕對(duì)û有問(wèn)題，我保證。
10.做SDS-PAGE的時(shí)候
除了蛋白量上樣一致，最好體積也一致，這樣跑出來(lái)的膠各個(gè)泳道之間的band能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是WB。做法就是拿1X的上樣緩沖補(bǔ)全要加的樣做到體積一致，否則跑出來(lái)會(huì)有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。
11.在把蛋白膠做成干膠時(shí)
很多時(shí)候會(huì)因?yàn)橛袣馀菔鼓z裂掉，我的經(jīng)驗(yàn)是在做膠時(shí)加上層膜前在膠上多加些水就不容易進(jìn)氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到60度烘箱里烘，這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會(huì)有影響，呵呵，這是經(jīng)驗(yàn)之談，我從來(lái)都û失手過(guò)，大家可以試試。
12.做大腸表達(dá)時(shí)
確定蛋白是否表達(dá)一般要煮樣做誘前誘后檢測(cè),但很多時(shí)候煮出來(lái)的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細(xì)菌再煮效果會(huì)有極大改善。
注:不能用Gu-HCl代替。
13.我也推薦幾個(gè)偷懶的方法
1. 做SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個(gè)懶覺而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體,所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過(guò)夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國(guó)外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期。
2. 配置分離膠或者非變性膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時(shí)用4度加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響。
3.推薦一個(gè)節(jié)約抗體/時(shí)間的做法:
同時(shí)跑2塊膠,同時(shí)轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時(shí)封閉,同時(shí)一抗二抗(最好是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時(shí)間幫它們翻個(gè)身以保證兩張膜的正面都有機(jī)會(huì)與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強(qiáng)洗膜也可以不做.我最多一張盤子里放4張膜而û有影響洗膜).可分別或同時(shí)壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時(shí)間而不會(huì)影響結(jié)果。
或者另外一個(gè)就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但ÿ次都會(huì)減弱,效果不如上面一種方法。
14.做western blotting 轉(zhuǎn)膜時(shí)
膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝 好轉(zhuǎn)膜裝置，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過(guò)要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)λ移動(dòng)了，以防m(xù)aker失去參照價(jià)值。
15.超濾最合適用于蛋白的濃縮
更換緩沖液和除鹽，對(duì)于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實(shí)是有很大差別的。
16.關(guān)于Western Blot
1)器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來(lái)水反復(fù)沖洗，確保無(wú)洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2-3遍，然后用去離子水沖洗一遍。最后用95%酒精再擦一遍后晾干備用。
2)配膠最好現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠(分離膠)，后配上層膠(濃縮膠或積層膠)，而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1-2次即可。
17.跑蛋白page的時(shí)候
一開始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用20ul槍+普通小白槍頭點(diǎn)，非常省事。另外，點(diǎn)樣時(shí)有可能看不清孔在哪，看遠(yuǎn)離你的那面膠，孔有反光的。點(diǎn)樣也點(diǎn)你對(duì)面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛惜自己。
18.垂直電泳時(shí)
可在電泳糟中放入青ù素小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。
19.我們有時(shí)要沉淀東西時(shí)
由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有û沉淀下來(lái)東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時(shí)建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部λ，這樣離心后就可直接觀察那有û有沉淀，避免滿管子找，另外看沉淀時(shí)可以對(duì)光看，這樣就是顆粒狀的細(xì)小沉淀也能看見的。
20.大家都知道PMSF有劇毒
以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實(shí)也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達(dá)你所要的濃度。這樣就避免了你長(zhǎng)時(shí)間和它接觸。
21.跑好SDS-PAGE膠的一些體會(huì)：
1. 清洗好玻璃板，不要偷懶，很多時(shí)候跑完電泳撬膠時(shí)會(huì)因?yàn)椴ＡО宀桓蓛裟z粘在板上把膠撬破。
2. 配膠時(shí)不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會(huì)導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。
3. AP分裝成500微升一管保存放-20度，避免AP用太久失效。
4. 倒膠時(shí)把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因?yàn)槲⒘康乃嬖跁?huì)影響配的膠濃度。
5. 盡量不用過(guò)夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。
6. 電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動(dòng)幾次膠很容易就脫落下來(lái)，一點(diǎn)û有問(wèn)題，方便的很。
7. 點(diǎn)樣時(shí)樣品別忘了離心這步，因?yàn)樯蠘雍泄腆w沉淀會(huì)影響電泳圖分辨效果。
8. 盡量在冰浴狀態(tài)下跑。
22.關(guān)于２－ＤＥ
總結(jié)了幾個(gè)小竅門：
1.一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在 膠槽的兩側(cè).剪一小段IPG膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋，電壓就容易上去了。避免一向電泳不好影響最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2. SDS-PAGE時(shí),在灌膠之前,一般大家都會(huì)用凡士林封底, 在SDS-PAGE電泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗(yàn)是:不用凡士林,取少量δ加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠方面,效果好!
23.蛋白質(zhì)純化時(shí)
蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加pmsf，建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加pmsf(蛋白降解抑制劑)，一定要用之前再加。
24.做透析的時(shí)候
拿一個(gè)5ml的槍頭或者是其他類似的東西，剪短，穿過(guò)個(gè)塑料泡沫之類的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開口綁緊在5ml槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過(guò)來(lái)綁成u字型。這樣就可以用1ml的槍穿過(guò)5ml的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來(lái)加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對(duì)同一個(gè)蛋白大量多次透析非常方便
25.自己的實(shí)驗(yàn)技巧：
1. 配SDS-PAGE膠時(shí)，用槍頭混勻比較麻煩，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效果也不好。可以剪一小段夾文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。
2. 上面的站友也說(shuō)過(guò)，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。
3.電泳后考馬斯亮藍(lán)染色一般要1h到2h，脫色也要2h左右，麻煩的很。現(xiàn)在給大家說(shuō)一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，是我從一個(gè)師姐那里學(xué)到的。加入染色液后，先放入微波¯里加熱5-10秒，使染色液微熱即可(千萬(wàn)不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了)。然后放水平搖床上搖20分鐘，最多半小時(shí)就染好了。
脫色也很簡(jiǎn)單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波¯里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)，不如那樣清楚，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料(用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液)。
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