1.1 食品檢樣

巴氏消毒牛奶、原味面包

1.2 儀器

全自動菌落分析儀

立式壓力蒸汽滅菌器

生化培養箱

均質機

恒溫水浴鍋

培養皿（直徑90mm）

1.3 試劑

瓊脂

平板計數瓊脂（PCA）

氯代三苯基四氮唑（TTC）

首先將購買的巴氏消毒牛奶和面包放置使它們過期，牛奶過期 8h，面包過期96h，通過過期處理有助于菌落蔓延的形成。整個檢驗步驟按照國家標準 GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗菌落總數測定》（以下簡稱國標）進行。每種樣品做10^-2、10^-3、10^-4，3個連續稀釋度，每個稀釋度每組做12個檢驗平板、2個空白平板。

2.1 對照組

按照國標正常檢測，制成檢驗培養基平板后培養基不加覆蓋。

2.2 加覆蓋組

按照國標法制作檢驗平板后，加入 5 mL 滅菌培養基覆蓋住原培養基。采用兩種不同的覆蓋方案，加覆蓋組一是檢驗平板做好后，加入的覆蓋培養基的瓊脂質量分數為2.0%（配方：瓊脂 20g，水 98g），加覆蓋組二瓊脂含量質量分數為4.0%（配方：瓊脂40g，水960g）。

2.3 加濾紙組

培養皿滅菌前在培養皿皿蓋中放置兩層濾紙，目的是在菌落總數檢測培養的過程中可以吸收一定量的冷凝水，防止微生物細胞或孢子隨著冷凝水遷移，減少菌落蔓延的發生，然后按照國標法制作不加覆蓋的平板。

2.4 加 TTC 組

每 100 mLPCA 培養基中加人0.1%TTC溶液2.5mL混勻，按照國標法制作不加覆蓋的平板。TTC 染色液能夠使菌落呈現紅色而培養基和食品殘渣顆粒不會被染色，有利于菌落計數時真實菌落的鑒別，且不會對微生物特別是細菌的生長繁殖造成影響。

將制成的平板翻轉，36 ℃培養 48 h。首先計數不同組別、不同稀釋度檢驗平板菌落蔓延情況，然后使用全自動菌落分析儀計數不同稀釋度不蔓延平板的微生物菌落數量，空白平板均無菌落生長。根據檢測結果分別統計過期牛奶的菌落蔓延情況、過期面包菌落蔓延情況和過期牛奶面包的菌落總數檢驗情況，制成表1~表3。

3.1 過期巴氏消毒牛奶不同組別、不同稀釋度菌落蔓 延情況統計

過期巴氏消毒牛奶不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統計見表 1。

3.2 過期面包不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統計

過期面包不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統計見表 2。

3.3 菌落總數檢測結果

菌落總數檢測結果見表 3。

從以上3.1過期巴氏消毒牛奶不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統計表和3.2過期面包不同組別、不同稀釋度菌落蔓延情況統計表中可以看出不經過處理的對照組平板，菌落蔓延非常嚴重，巴氏消毒牛奶和面包分別達到了77.8%、94.4%；加TTC組菌落蔓延也很嚴重，均達到了75.0%，與對照組相比有所改善；加濾紙組菌落蔓延分別達到了69.4%和75.0%，菌落蔓延對檢驗的影響也較大；加覆蓋組一菌落蔓延分別達到了38.9%、44.4%，對菌落蔓延有較好的抑制作用，可以保證檢驗得到結果；加覆蓋組二菌落蔓延分別達到了25.0%、27.8%，菌落蔓延的到了較好的控制，是防止菌落蔓延所有試驗方法中最佳的。

對 3.3 菌落總數檢測結果分析：以過期巴氏消毒牛奶為例：對照組、加 TTC組、加濾紙組、加覆蓋組一、加覆蓋組二平均菌落數分別為91000、91000、87000、89000、80000 CFU/mL，各組得到的數據相差不大，對食品檢驗的最后報告不會造成實際的影響，說明檢驗過程中通過一定的方法防止菌落蔓延對檢驗結果的影響較小，可以在實際工作中采用。分析過期面包的檢驗結果可以得到同樣的結論。

控制菌落蔓延在食品微生物檢測中非常重要，面包、饅頭、蛋糕、米粉、餅干等多種食品在檢驗過程中容易出現菌落蔓延情況，其他食品的檢驗也會或多或少出現，對檢驗工作造成困擾。加覆蓋組二對菌落蔓延的抑制作用很明顯，相比對照組平均下降52.8%和66.6%；加覆蓋組一的效果也不錯，相比對照組平均下降38.9%和50.0%。

同一種食品采用不同的配方、加工工藝、不同的溫度對微生物的影響不同，檢測的結果也有不同。本次研究的食品試驗材料只有2種，相對較少；同時受到配置稀釋液時間等限制，不可能一次做大量平板，對研究結果造成一定影響，結論僅供參考。