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本單元講述了無菌取樣操作，在討論無菌取樣的原因和采集方法之前，必須要理解“無菌的”的這一術(shù)語，“無菌”一般用于取樣中，意味著取樣過程中，避免操作引起污染。一個無菌樣品的采集，應(yīng)該通過這樣一種方式，即：在收集過程中，本身應(yīng)避免污染，然后放入消毒容器中。
無菌樣品的采集基本是為了支持、針對工廠的衛(wèi)生條件狀況的檢查結(jié)果。
一、檢驗前的準(zhǔn)備工作：
1．包裝無菌取樣的工具：
擁有正確的采取產(chǎn)品或加工過程的無菌取樣器械工具是至關(guān)重要的的。除非使用合適的采集工具，否則樣品的完整性會被懷疑，甚至樣品毫無意義。為了避免沒有合適的取樣工具，建議建立一個無菌取樣的分析清單，來收集取樣工具。如果可能盛樣品的容器在最初進(jìn)入加工區(qū)之前應(yīng)當(dāng)被預(yù)先標(biāo)識，象樣品號、取樣日期、取樣人等。這樣可以使在不同的工廠條件下的樣品取樣更為方便一些。附加樣品號碼一般在樣品采集中被正式確定下來，因此不用預(yù)先標(biāo)明。
人員的工具設(shè)施，象工作服、發(fā)網(wǎng)或消毒處理過的清潔的鞋靴必須具備有助于證明采集者沒有污染到食物產(chǎn)品或樣品。
2．生產(chǎn)線樣品In-Line Samples：
生產(chǎn)線樣品一般是指原材料，原料生產(chǎn)用水、包裝材料或其他任何使用在生產(chǎn)線的材料。
生產(chǎn)線樣品的采集一般用來確定細(xì)菌污染源是否來自于原材料或加工序中的某些地方。
3．環(huán)境樣品：
環(huán)境樣品用細(xì)菌拭子，（注：細(xì)菌拭子樣品不能給出／測出微生物的定時結(jié)果，因為樣品非常小，顯著微生物會經(jīng)常丟失），棉拭子的取樣部位一般來自于食品接觸面，地板噴濺物。墻壁、頂部管道和檢驗中考察的其他潛在污染源程序，并且記錄可能的聯(lián)系，在環(huán)境樣品來源和食物產(chǎn)品的污染方面，可以使樣品具有意義，并且是提倡這樣做的，例如：
地面噴濺水：工人從有地面污水的地方走過后又回到加工區(qū)域嗎？
墻壁：墻壁上面和在制品上面有昆害蟲嗎？
天花板：冷凝物或噴漆有無掉落到產(chǎn)品上或被發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)品相接觸？
4．某些準(zhǔn)備
干冰：（有的稱為gel backs）
如果使樣品在貯運(yùn)過程中保持冷卻，一些種類的制冷劑是必需的。檢查觀看干冰袋子是否有接觸，如果泄漏可能污染樣品，你也可以用濕冰，濕冰可以由工廠提供，然而取樣前必須清楚這一點(diǎn)，如果想保持樣品冷凍，干冰應(yīng)在檢驗前獲得。
盒子或制冷皿：
檢驗員需要貯藏、運(yùn)輸他們的樣品，如果樣品不需冷凍，那么用一個盒子即可，但如果樣品需要冷卻，一個標(biāo)準(zhǔn)的制冷皿或保溫箱是必須使用的，一般來講制冷皿隨帶著一個塑料袋，樣品可以放還袋子里，制冷劑象干冰，等可以放置在袋外，這樣樣品被冰污染的可能性就被避免了。
滅菌容器：
從塑料袋到滅菌的加侖漆桶，可以用于有銳利邊面的產(chǎn)品如蟹、蝦等。
取樣工具：
取樣工具包括：茶匙、角匙、尖嘴鉗、fovceps tongs 量筒和燒杯，工具的類型一般由取樣產(chǎn)品來決定。
所有取樣設(shè)施和容器的滅菌日期應(yīng)當(dāng)被檢查、滅菌時間應(yīng)當(dāng)在儀器設(shè)施的標(biāo)簽和包裝上標(biāo)明，一些儀器設(shè)施可以在當(dāng)?shù)貙?shí)驗室滅菌處理或購買滅菌儀器，在當(dāng)?shù)貙?shí)驗室滅菌的儀器設(shè)施一般可以保持至少兩個月，過期后設(shè)施必須重新滅菌。
滅菌手套：
滅菌手套在采樣中并非必須啟用，如果一個產(chǎn)品在樣品收集過程中必須被接觸，那么最好讓工廠生產(chǎn)線的工人來做（加工處理產(chǎn)品的工人），將樣品放入收集容器中，既然工人在生產(chǎn)過程中處理接觸產(chǎn)品，那么我們就不能認(rèn)為他們對產(chǎn)品又有附加的污染。
當(dāng)用手套時必須用一種避免污染的方式戴上，手套的大小必須適合工作的需要。
無菌棉拭子：
一般用于拭取儀器設(shè)施和工廠環(huán)境區(qū)域，使用棉拭子一般有一個正確的程序，打開棉拭子剝掉表皮，然后必須小心的放在試管頭上，注意不要沾染棉拭子的外端；下一步擦拭要取樣的部位，象案板頭或頂部管道，然后從試管頭上小心翼翼地將拭子放入——將其全部堆入直到試管中部。
滅菌全包裝袋：
袋子必須購買滅菌的，使用時只需撕掉封頭，用提供的地方張開袋子，將樣品放入，然后將袋子頂端卷起，用線繩扎實(shí)牢；底部應(yīng)當(dāng)折疊兩次，以便線繩不會穿透塑料袋，導(dǎo)致樣品泄露。
當(dāng)樣品收集時，樣品采集時的條件例如產(chǎn)品的溫度、地點(diǎn)等，連同扦樣樣品號嘜頭，一并記錄入檢驗員的注釋說明中，取樣的樣品可以從樣品號、采集日期、附加樣品號，最初調(diào)查人和其他鑒別信息事區(qū)分。
當(dāng)采集無菌樣品時，一條最重要的規(guī)則是：千萬別污染樣品。
這需要樣品采集人非常小心地采集所有附加樣品，確保不違反這條規(guī)則。
二、取樣方案
微生物檢驗的特點(diǎn)是一個以小份樣品的檢測結(jié)果來說明一大批食品衛(wèi)生質(zhì)量，因此，用于分析的樣品的代表性至關(guān)重要，也即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。要保證樣品的代表性首先要有一套科學(xué)的抽樣方案，其次使用正確的抽樣技術(shù)，并在樣品的保存和運(yùn)輸過程中保持樣品的原有狀態(tài)。
一般說來，進(jìn)出口貿(mào)易合同對食品抽樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定抽樣；進(jìn)出口貿(mào)易合同沒有具體抽樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和分析方法的性質(zhì)確定抽樣方案。目前最為流行的抽樣方案為ICMSF推薦的抽樣方案和隨機(jī)抽樣方案，有時也可參照同一產(chǎn)品的品質(zhì)檢驗抽樣數(shù)量抽樣，或按單位包裝件數(shù)N的開平方值抽樣。無論采取何種方法抽樣，每批貨物的抽樣數(shù)量不得少于5件。對于需要檢驗沙門氏菌的食品，抽樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于8件。
ICMSF推薦的抽樣方案
ICMSF的采樣設(shè)想及其基本方法
用于分析所抽樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果會產(chǎn)生很大影響。在某些情況下用于分析的樣品可能代表所抽“一批”（lot）樣品的真實(shí)情況，這適合于可充分混合的液體，如牛奶和水。
在“多批”（Lots或“batchers”）食品的情況下就不能如此抽樣，因為“一批”容易包含在微生物的質(zhì)量上差異很大的多個單元。因此在選擇抽樣方案之前，必須考慮諸多因素（ICMSF，1986），包括：
——檢驗?zāi)康?/font>
——產(chǎn)品及被抽樣品的性質(zhì)
——分析方法
ICMSF提出的采樣基本原則，是根據(jù)（1）各種微生物本身對人的危害程度各有不同。（2）食品經(jīng)不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度，來設(shè)定抽樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)。目前，加拿大、以色列等很多國家已采用此法作為國家標(biāo)準(zhǔn)。在進(jìn)行詳細(xì)敘述之前，先解釋四個代號：
n：系指一批產(chǎn)品采樣個數(shù)。
c：系指該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過限量的檢樣數(shù)，即結(jié)果超過合格菌數(shù)限量的最大允許數(shù)。
m：系指合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開。
M：系指附加條件，判定為合格的菌數(shù)限量，表示邊緣的可接受數(shù)與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。
1．ICMSF的采樣方法
有些實(shí)驗室在每批產(chǎn)品中，僅采一個檢樣進(jìn)行檢驗，該批產(chǎn)品是否合格，全憑這個檢樣來決定。ICMSF方法與此不同，它是從統(tǒng)計學(xué)原理來考慮，對一批產(chǎn)品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產(chǎn)品的質(zhì)量而設(shè)定的。ICMSF方法中包括二級法及三級法兩種。二級法只設(shè)有n、с及m值，三級法則有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。
�。�1）二級抽樣方案。自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點(diǎn)作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過m值的，則為不合格品。檢查在檢樣是否有超過m值的，來判定該批是否合格。以生食海產(chǎn)品魚為例n=5，c=0，m=102，n=5即抽樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。
�。�2）三級抽樣方案。設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)m及M值兩個限量如同二級法，超過m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果，允許≤3個檢樣的菌數(shù)是在m�M值之間，如果有3個以上檢樣的菌數(shù)是在m�M值之間或一個檢樣菌數(shù)超過M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。
（3）．ICMSF對食品中微生物的危害度分類與抽樣方案說明
為了強(qiáng)調(diào)抽樣與檢樣之間的關(guān)系，ICMSF已經(jīng)闡述了把嚴(yán)格的抽樣計劃與食品危害程度相聯(lián)系的概念（ICMSF，1986）。在中等或嚴(yán)重危害的情況下使用二級抽樣方案，對健康危害低的則建議使用三級抽樣方案。
ICMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理條件三者綜合在一起進(jìn)行食品中微生物危害度分類的。這個設(shè)想是很科學(xué)的，符合實(shí)際情況的，對生產(chǎn)廠及消費(fèi)者來說都是比較合理的。下面結(jié)合表1加以說明。
表1、ICMSF按微生物的危害度及食品處理進(jìn)行情況分類
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級別 |
危害程度 |
對象微生物 |
食品經(jīng)不同處理后的危害度 |
||
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減少（加熱） |
無變化（冷凍品立刻進(jìn)食） |
增加危害度（未加熱吃到吃前還有一段時間） |
|||
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三級方案 |
1.食品的保藏
2.輕度間接指標(biāo)菌
3.中度程度局部傳播 |
細(xì)菌數(shù)
大腸菌群 大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 （指標(biāo)菌）
金黃色葡萄球菌 蠟樣芽孢桿菌 產(chǎn)氣莢膜梭菌 |
例1 n=5 c=3 例4 n=5 c=3
例7 n=7 c=2 |
例2 n=5 c=2 例5 n=5 c=2
例8 n=5 c=1 |
例3 n=5 c=1 例6 n=5 c=1
例9 n=10 c=1 |
|
二級方案 |
1.中度程度廣泛傳播
2.嚴(yán)重程度 |
沙門氏菌副溶血性弧菌致病性大腸桿菌
肉毒梭菌 霍亂弧菌 傷寒沙門氏菌 副傷寒沙門氏菌 |
例10 n=5 c=0
例13 n=15 c=0
|
例11 n=10 c=0
例14 n=30 c=10
|
例12 n=20 c=3
例15 n=60 c=0 |
注：表中“減少”系指食品經(jīng)加熱殺死污染的細(xì)菌。
“無變化”系指微生物數(shù)不增減例如冷凍食品或干燥食品。
“增加”系指將食品保存在不良環(huán)境中使微生物易于繁殖和產(chǎn)毒。
根據(jù)上表15種情況的舉例，1-3可用三級法，4-5可用二級法來判定是否合格。
考慮到以上15種情況，分別設(shè)定不同的取檢樣數(shù)及檢樣污染數(shù)，在1-9例種檢樣需采5個（n=5），而污染檢樣數(shù)設(shè)定為c=3，2，1。在10-15例用二級法則不得檢出該致病菌c=0。例如冷凍食品，細(xì)菌數(shù)按例2，大腸菌按例5，金黃色葡萄球菌按例8，沙門氏菌按例11的二級法判定。
對食品處理應(yīng)酌情考慮，例如生肉火腿中的金黃色葡萄球菌，被腐敗菌所抑制，不易發(fā)生食物中毒，適用例7和例8。烹調(diào)加工后的熟肉，對腐敗菌沒有抵抗力，則易發(fā)生食物中毒，適用例9。加熱鹽腌的火腿，水分活性為0.86以下，金黃色葡萄球菌有增殖的可能性，因此適用例9。沙門氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，適用例11，如上所述，應(yīng)根據(jù)各種食品的危害度進(jìn)行設(shè)定。
ICMSF方法是以二級法、三級法和抽樣的概念為基礎(chǔ)，再將微生物的知識加進(jìn)來，則可以提出各種食品的微生物標(biāo)準(zhǔn)。如表2。
為了安全，冷凍生蝦加熱吃，減少危害度適用例1、4、10。冷凍加工蝦，為了不加熱就食，在解凍中有增強(qiáng)危害度的可能性，適用例3、6、9、12，對象微生物特別指定金黃色葡萄球菌腸毒素，兩者雖菌數(shù)限量是相同的，但情況有所不同，分別適用c=3，c=1，因此不依靠菌數(shù)限量，而用合格率來控制。
表2、ICMSF蝦的微生物標(biāo)準(zhǔn)
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食品名稱 |
檢查項目 |
例 |
級別 |
n |
c |
菌數(shù)限量/g |
|
|
m |
M |
||||||
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冷凍生蝦
冷凍烹調(diào)蝦 |
細(xì)菌數(shù) 大腸菌群 金黃色葡萄球菌 副溶血性弧菌 細(xì)菌數(shù) 大腸菌群 金黃色葡萄球菌 副溶血性弧菌 |
1 4 4 10 3 6 9 12 |
3 3 3 2 3 3 3 2 |
5 5 5 5 5 5 5 5 |
3 3 3 0 1 1 1 0 |
106 4 103 102 106 4 103 102 |
107 400 2×103 — 107 400 2×103 — |
（4）.隨機(jī) 抽樣方案
在現(xiàn)場抽樣時，可利用隨機(jī)抽樣表進(jìn)行隨機(jī)抽樣。隨機(jī)抽樣表系用計算機(jī)隨機(jī)編制而成，包括一萬個數(shù)字。其使用方法如下：
a.先將一批產(chǎn)品的各單位產(chǎn)品（如箱、包、盒等）按順序編號。如將一批600包的產(chǎn)品編為1、2……600。
b.隨意在表上點(diǎn)出一個數(shù)。查看該數(shù)字所在的行和列。如點(diǎn)在第48行、第10列的數(shù)字上。
c.根據(jù)單位產(chǎn)品編號的最大位數(shù)（如A1，最大為三位數(shù)），查出所在行的連續(xù)列數(shù)字（如A2所點(diǎn)數(shù)為第48行、第10、11和12列，其數(shù)字為245），則編號與該數(shù)相同的那一份單位產(chǎn)品，即為一件應(yīng)抽取的樣品。
d.繼續(xù)查下一行的相同連續(xù)列數(shù)字（如按A3、即第49行的第10、11和12列的數(shù)字，為608）。該數(shù)字所代表的單位產(chǎn)品為另一件應(yīng)抽取的樣品。
e.依次按A4所述方法查下去。當(dāng)遇到所查數(shù)超過最大編號數(shù)量（如第50行的第10、11和12列的數(shù)字為931、大于600）則舍去此數(shù)，繼續(xù)查下一行相同列數(shù)，直到完成應(yīng)抽樣品件數(shù)為止。
三、抽樣方法
確定了抽樣方案以后，抽樣方法對抽樣方案的有效執(zhí)行和保證樣品的有效性代表性至關(guān)重要。抽樣必須遵循無菌操作程序，抽樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應(yīng)當(dāng)高壓滅菌，防止一切可能的外來污染。容器必需清潔、干燥、防漏、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。抽樣全過程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。確定檢驗批，應(yīng)注意產(chǎn)品的均質(zhì)性和來源，確保檢樣的代表性。常見的抽樣方法有：
1．直接食用的小包裝食品：
盡可能取原包裝，直到檢驗前不要開封，以防污染。
2．統(tǒng)裝或大容器包裝的液體食品：
�。�1）．抽樣前搖動或用滅菌棒攪拌液體，盡量使其達(dá)到均質(zhì)；
（2）．抽樣時應(yīng)先將抽樣用具浸入液體內(nèi)略加漂洗，然后再取所需量的樣品，裝人滅菌盛樣容器的量，不應(yīng)超過其容量的四分之三，以便于檢驗前將樣品搖勻；
�。�3）．取完樣品后，應(yīng)用消毒的溫度計插入液體內(nèi)測量食品的溫度，并作記錄。盡可能不用水銀溫度計測量，以防溫度計破碎后水銀污染食品；
（4）．如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所抽樣品冷卻至0-4℃。
3．統(tǒng)裝或大容器包裝的固體和固體食品：
�。�1）．每份樣品應(yīng)用滅菌抽樣器由幾個不同部位采取，一起放入一個滅菌容器內(nèi)；
�。�2）．注意不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細(xì)菌增殖。
4．統(tǒng)裝或大容器包裝的冷凍食品
�。�1）．對大塊冷凍食品，應(yīng)從幾個不同部位用滅菌工具抽樣，使之有充分的代表性。
（2）．在將樣品送達(dá)實(shí)驗室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。
5．生產(chǎn)過程中的抽樣：
�。�1）．劃分檢驗批次，應(yīng)注意同批產(chǎn)品質(zhì)量的均一性；
�。�2）．如用固定在貯液桶或流水作業(yè)線上的抽樣龍頭抽樣時，應(yīng)事先將龍頭消毒；
�。�3）．當(dāng)用自動抽樣器取不需要冷卻的粉狀或固定食品時，必須履行相應(yīng)的管理辦法，保證產(chǎn)品的代表性不被人為地破壞。
四、樣品的標(biāo)記、保存和運(yùn)送：
抽樣過程中應(yīng)對所抽樣品進(jìn)行及時、準(zhǔn)確的標(biāo)記；抽樣結(jié)束后，應(yīng)有抽樣人寫出完整的抽樣報告，使樣品盡可能保持在原有條件下迅速發(fā)送到實(shí)驗室。
1．樣品的標(biāo)記
（1）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記。在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號碼和樣品順序號以及其他需要說明的情況。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會被擦掉或脫色。
�。�2）當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職抽樣人員運(yùn)送時，必須封識樣品容器。
2.樣品的保存和運(yùn)送
�。�1）抽樣結(jié)束后應(yīng)盡快將樣品送往實(shí)驗室檢驗。如不能及時運(yùn)送，冷凍樣品應(yīng)存放在-15℃以下冰箱或冷藏庫內(nèi)；冷卻和易腐食品存放在0-4℃冰箱或冷卻庫內(nèi)；其他食品可放在常溫冷暗處。
�。�2）運(yùn)送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。必要時可于途中補(bǔ)加冷卻劑或冷凍劑。
（3）如不能由專人攜帶送樣時，也可托運(yùn)。托運(yùn)前必須將樣品包裝好，應(yīng)能防破損，防凍結(jié)或防易腐和 冷凍樣品升溫或融化。在包裝上應(yīng)注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字樣。
（4）作好樣品運(yùn)送記錄，寫明運(yùn)送條件、日期、到達(dá)地點(diǎn)及其他需要說明的情況，并由運(yùn)送人簽字。
