（1）無論何種抽樣方案,均要求樣品有代表性。采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。

如果是冷凍樣品按要求冷凍保藏，干燥食品可放在常溫冷暗處，易腐和冷藏樣品應(yīng)放入10℃環(huán)境。冷凍樣品來不及檢驗應(yīng)放入-15℃以下冰箱內(nèi)，待檢樣品存放時間不應(yīng)超過36h。

（2）樣品解凍

如果是冷凍樣品，樣品取出后，在0-8℃的冰箱中解凍，時間不超過18小時；也可在溫度不超過45℃環(huán)境中解凍，時間不超過15min。

（3）檢測前準(zhǔn)備

實驗前將工器具移到無菌間，最好用紫外線照射20min分鐘滅菌消毒，達(dá)到無菌狀態(tài)。

操作試驗的準(zhǔn)備物品均質(zhì)杯、酒精及酒精棉、移液器、滅菌槍頭、平皿、稀釋液、剪刀、鑷子、無菌盆或筐等物品，檢查一下是否齊全。

二、檢測

1、 樣品標(biāo)識

將樣品進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)識標(biāo)記，其中菌落總數(shù)按照4789.2操作，每一個稀釋度做兩個平行，一般做三個稀釋度每個樣品一摞。如圖1：

圖1

大腸菌群及金黃色葡萄球菌按照4789.3和4789.10中的MPN法檢測，每個稀釋度3根管，一般也是做3個稀釋度。如圖2：

2 取樣

先將樣品外包裝正反面用酒精噴灑（如果樣品表面有冷凝水先擦拭干凈后再用酒精噴灑）

（1）固體樣品

① 75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀剪開。

② 在電子稱上放上均質(zhì)杯去皮調(diào)整至零。

③ 用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣，稱取25g有代表性樣品。

④ 加入225ml滅菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水（開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應(yīng)在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌）后。

⑤ 擦拭干凈剪刀鑷子后浸泡于75%酒精容器中。

⑥將均質(zhì)杯蓋上蓋子后8000轉(zhuǎn)均質(zhì)1-2min后作為樣液。

（2）液體樣品

①冷凍樣品完全解凍后使用。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，用滅菌吸管取充分混合后樣25ml。

③加入225ml滅菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水混勻作為樣液。

(3) 粉末狀樣品以及半固體樣品

①將樣品混合均勻。

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，以無菌匙采取混合后樣10g。

③加入90ml滅菌磷酸鹽緩沖液，開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應(yīng)在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌。

④余同上。

三、稀釋方法

①從均質(zhì)杯準(zhǔn)確吸取樣液1mL混勻的樣液，然后沿管壁徐徐接種到含9ml磷酸鹽緩沖液里，蓋上試管塞后充分震蕩混勻為1：100稀釋液。（一定要槍頭尖端伸入稀釋液內(nèi)2-3mL，以免吸入空氣進(jìn)入移液器，污染樣品造成實驗失敗。）

③重復(fù)該操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀釋液。

④為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞增稀釋時（原液在前稀釋液在后），每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應(yīng)更換一個槍頭。

⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。

四、樣液接種方法：

① 在無菌室，取出滅菌的槍頭或者滅菌的移液器，

② 準(zhǔn)確吸取樣品勻液，1mL、1mL、1mL無菌操作分別以2～4s內(nèi)完全注入已標(biāo)識清楚的菌落總數(shù)平皿、大腸菌群以及金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中。

③  如果某一樣品液在接種前放置時間超過3 min，應(yīng)重新均質(zhì)。

④ 為了驗證稀釋液、培養(yǎng)基、平皿、槍頭等器具無菌需做空白對照。

五、傾注培養(yǎng)基

右手持培養(yǎng)基三角瓶（已放46℃的水浴中恒溫）置火焰旁邊，用左手拇指和食指或中指使平皿開啟不超過30°，迅速倒人培養(yǎng)基約15-20ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，左三圈，右三圈，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面。

六、培養(yǎng)

●  平皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中(每垛最多堆放6個平皿，平皿間要留有空隙進(jìn)行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達(dá)到一致)，按所規(guī)定的時間溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

●  斜面、高層斜面、液體培養(yǎng)基立在試管架上放入恒溫培養(yǎng)箱中，按所規(guī)定的時間溫度進(jìn)行培養(yǎng)，如圖。

七、計數(shù)判定及注意事項

●由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大。計數(shù)時一般用菌落計數(shù)器仔細(xì)觀察。必要時用放大鏡檢查，以防遺漏尤其是平皿邊緣生長的菌落。

●計數(shù)方法參照GB 4789.2-2022方法。

●稀釋度低的培養(yǎng)皿，微生物菌落和食品碎渣很難區(qū)分，一般吸取過濾網(wǎng)過濾后的稀釋液以減少食品碎渣的影響;

●為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。

● 必要時，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在平板計數(shù)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑TTC（100ml加入1ml 0.5%TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。

● 在發(fā)酵試驗中，發(fā)酵倒管的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡，或發(fā)酵時產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡，都應(yīng)作進(jìn)一步試驗。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的發(fā)酵有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳?xì)馀菀粯樱�即�?yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗。