手機版
人沙門氏菌病有四類綜合癥：沙門氏菌病；傷寒；非傷寒型沙門氏菌敗血癥和無癥狀帶菌者。沙門氏菌胃腸炎是由除傷寒沙門氏菌外任何一型沙門氏菌而所致，通常表現(xiàn)為輕度，持久性腹瀉。傷寒實際上是由傷寒沙門氏菌所致。未接受過治療的病人致死率可超過10%，而對經(jīng)過適當醫(yī)療的病人其致死率低于1%，幸存者可變成慢性無癥狀沙門氏菌攜帶者。這些無癥狀攜帶者不顯示發(fā)病癥狀仍能將微生物傳染給其他人(傳統(tǒng)的例子就是瑪麗傷寒)。
非傷寒型沙門氏菌敗血癥可由各型沙門氏菌感染所致，能影響所有器官，有時還引起死亡。幸存者可變成慢性無癥狀沙門氏菌攜帶者。
一、致病性
沙門氏菌胃腸炎，潛伏期一般6-72小時，主要癥狀為惡心、嘔吐、腹絞痛、腹瀉、發(fā)熱寒顫頭痛。病程一般1-2天或更長。感染劑量為15-20個菌，死亡率達1-4%。最易感群體是年幼兒童、虛弱者、年長老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的糞便，沙門氏菌常存在于動物中，特別是禽類和豬。在許多環(huán)境中也有存在。從水，土壤，昆蟲中，從工廠和廚房設施的表面和動物糞便中已發(fā)現(xiàn)該類細菌。它們可以存在于多類食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，魚，蝦和田雞腿，酵母，椰子，醬油和沙拉調料，蛋糕粉，奶油夾心甜點，頂端配料，干明膠，花生露，橙汁，可可和巧克力。
沙門氏菌屬也是嗜溫性細菌，在中等溫度，中性pH，低鹽和高水活度條件下生長最佳。生長最低水活度為0.94。兼性厭氧，對中等加熱敏感。同樣，該菌屬能適應酸性環(huán)境。通過衛(wèi)生以防止二次污染；蒸煮；巴氏消毒等控制。正常家庭烹調，個人衛(wèi)生可以防止煮熟食品的二次污染，以及控制時間和溫度一般都能充分防止沙門氏菌病的發(fā)生。
二、檢驗
因沙門氏菌是最常見的食源性細菌病原體，因此在本節(jié)中重點介紹沙門氏菌的檢驗。沙門氏菌是食物傳播病原菌中研究最活躍的細菌。從食品中分離和鑒定沙門氏菌，當前通用的方法學分5個步驟：
1.前增菌-第一步使食物樣品在含有營養(yǎng)的非選擇性培養(yǎng)基中增菌，使受損傷的沙門氏菌細胞恢復到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。
2.選擇性增菌-在含選擇性抑制劑的促生長培養(yǎng)基中間，樣品進一步增菌的一個步驟。此培養(yǎng)基允許沙門氏菌持續(xù)增殖，同時阻止大多數(shù)其他細菌的增殖。
3.選擇性平板分離-這一步采用固體選擇性培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識別。
4.生物化學篩選-排除大多數(shù)非沙門氏菌。也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬的初步鑒定。
5.血清學技術提供了培養(yǎng)物菌種的鑒定。
這五個步驟代表理想狀況。不過一個有經(jīng)驗的檢驗員，可能在一個或幾個步驟中看出特性和差別。
目前檢驗食品中的沙門氏菌是按統(tǒng)計學取樣方案為基礎，25g食品為標準分析單位。
三、從食品中分離沙門氏菌樣品的制備
下面的方法是以25g樣品為檢測單位，樣品：肉湯為1∶9的比例。除非另有說明，根據(jù)混合程度，加足夠的肉湯保持1∶9的比例。對不需準確稱量檢測的樣品，例如：田雞腿，可參看特定方法說明。
1、干蛋黃、干蛋白、干全蛋、液奶（去脂牛奶，含2%脂肪牛奶，全脂奶，和脫脂奶）、粉狀調制食品（蛋糕，甜餅，炸面圈，餅干和面包）、嬰兒食品、口食或軟管進食含蛋的食品：
檢驗前的冷凍樣品最好不要解凍。如果冷凍樣品必須軟化以獲取待檢測部分，則盡可能迅速的解凍所需部分，使競爭菌數(shù)少增加或降低沙門氏菌的可能損傷。解凍需在45℃以下，有自動調溫器自控的水浴鍋內不斷攪拌進行15min或在2�5℃，18小時內解凍。無菌操作稱取25g樣品，放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶中（500mL）或其他合適的容器內。非粉狀的樣品，加入225mL滅菌乳糖肉湯。如果制品是粉狀，加入約15mL滅菌乳糖肉湯，用滅菌玻璃棒，匙或滅菌壓舌器攪拌，使成均勻懸液。再加3份乳糖肉湯10mL，10mL，190mL，使總量為225mL。充分攪拌，直到樣品完全懸浮沒有團塊為止。蓋緊瓶蓋在室溫靜置60min。振搖使充分混勻，用試紙測定pH值。必要時用滅菌的1NNaOH或1NHcl調節(jié)pH至6.8±0.2。在測定最終pH前要蓋緊瓶蓋并充分混勻。然后將瓶蓋旋松約1/4圈，置35℃培養(yǎng)24±2小時。以下步驟按四，1-10進行。
2、蛋類：
A、含殼蛋：用硬刷子在水流下刷洗蛋。把蛋在含0.1%十二烷酸磺酸鈉（SDS）的200ppm氯離子溶液中浸泡30min。加8mL 5.25%次氯酸鈉到含1g SDS的992mL蒸餾水中，制備200ppm cl-/0.1%SDS溶液。這種消毒劑需在使用前臨時制備。無菌操作打開蛋，使用滅菌的蛋分離器，棄去蛋白。無菌操作稱取25g蛋黃到滅菌的500mL錐型瓶或其他合適容器內。加225mL胰胳胨（胰化物）大豆肉湯（TSB），并振蕩充分混勻。在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2，置35℃培養(yǎng)24±2小時，以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
B、液全蛋（均狀）：無菌操作稱25g置于無菌的500mL錐形燒瓶或其它合適容器中。加225mLTSB并振蕩充分混勻。按上面所述繼續(xù)。
C、煮硬的蛋（雞蛋，鴨蛋或其他蛋類）：目前，不知道蛋白中的沙門氏菌抑制因子是否具有熱穩(wěn)定性。因此，無菌操作分離蛋白和蛋黃。稱取25g粉狀蛋黃固體到無菌500mL錐型瓶或其他合適容器中。加225mLTSB并旋轉充分混勻。按上面所述繼續(xù)。
3、脫脂乳粉
A、速溶：無菌操作稱取25g樣品，加入滅菌燒杯（250mL）或其它合適容器內。經(jīng)滅菌玻璃或紙質（用帶卷好以備高壓滅菌）漏斗，往滅菌的500mL錐形燒瓶或其它合適容器中（裝有225mL煌綠水），緩緩傾注25g檢測單位，使其覆蓋在煌綠水表面。也可將多份25g檢驗單位按比例 倒入相應份數(shù)的煌綠水表面。按每1000mL滅菌蒸餾水中加1%煌綠溶液2mL配置煌綠水。將盛有樣品�前增菌培養(yǎng)基的容器靜置60±5分鐘。松松地蓋上容器蓋，不需要混合或調節(jié)pH值，于35℃培養(yǎng)24±2小時，以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
B、非速溶：按上述A脫脂乳粉的方法進行，只不過不允許將多份檢驗單位按比例合并檢驗。
4、全脂奶粉：
無菌操作稱取25g樣品，加入無菌的，帶螺旋帽的廣口瓶中（500mL）或其他合適的容器內。加入225mL滅菌蒸餾水并振蕩充分混勻。蓋緊在室溫下靜置60分鐘。使其充分混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。在測定最終pH前要蓋緊瓶蓋并充分混勻。然后加0.45mL1%的煌綠染液并充分混勻。旋松瓶蓋約1/4轉后，置35℃培養(yǎng)24±2小時，以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
5、酪蛋白：
無菌操作稱取25g樣品，加入無菌均質杯中，加225mL滅菌乳糖肉湯到樣品中并勻質2分鐘。無菌操作，把已勻質的混合物轉移到滅菌，帶螺旋帽的500mL廣口瓶或其他合適的容器內。蓋緊蓋子在室溫下靜置60分鐘。振搖使充分混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。在測定最終pH前要蓋緊瓶蓋并充分混勻。旋松瓶蓋約1/4圈后，置35℃培養(yǎng)24±2小時，以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
6、大豆粉：
無菌操作稱取25g樣品，加入滅菌燒杯（250mL）或其它合適容器內。用滅菌玻璃或紙質（用帶卷好以備高壓滅菌）漏斗，往裝有225mL乳糖肉湯的滅菌的500mL錐形燒瓶或其它合適容器中，緩緩傾注25g檢測單位，使其覆蓋在乳糖肉湯表面。檢測單位（25g）不可多份按比例混合檢測。容器靜置60±5分鐘。松松地蓋上容器蓋，不需要混合或調節(jié)pH值，于35℃培養(yǎng)24±2小時，以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
7、含蛋制品（面條，蛋卷，通心粉，意大利面條）、干酪、生面團、調制色拉（火腿，蛋，雞肉，金槍魚，火雞）、新鮮的、冷凍的、或干的水果和蔬菜、果仁、甲殼類動物（小蝦，蟹，小龍蝦，LANGOSTINOS，龍蝦）和魚：
檢測前冷凍樣品最好不要解凍，如果冷凍樣品必須軟化以取其檢測部分，則要在持續(xù)攪拌并帶有自動調溫器控制的45℃水浴內15分鐘內解凍。或者在2�5℃18小時內進行。
無菌操作稱取25g樣品，加入滅菌的均質器中。加入225mL滅菌的乳糖肉湯并均質2分鐘。再無菌操作轉移已均質的混合物到無菌的帶螺旋帽的廣口瓶中（500mL）或其他合適的容器內。蓋緊瓶蓋，于在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。充分混勻。旋松瓶蓋約1/4轉后，置35℃培養(yǎng)24±2小時，以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
8、干酵母：
無菌操作稱取25g樣品，放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶中（500mL），或其他合適的容器內。加入225mL滅菌胰酪胨（胰化）大豆肉湯，充分混勻使酵母形成均勻懸液。蓋緊瓶蓋于在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻，用試紙測定pH值。必要時，調節(jié)pH值至6.8±0.2，在測定最終pH前要混合充分。旋松瓶蓋約1/4轉后，置35℃培養(yǎng)24±2小時。非活性干酵母，以下步驟按D，1-11進行。活性干酵母，混勻經(jīng)培養(yǎng)過的樣品，轉種1mL到10mL月桂基蛋白（LST）中，另轉種1mL到10mL四磺酸鹽（TT）肉湯中。將此兩種選擇性肉湯于35℃培養(yǎng)24±2小時。充分地旋轉混合經(jīng)培養(yǎng)過的增菌肉湯，每種肉湯都要用3mm接種環(huán)劃線接種3個選擇性平板（四，3和四，4），接下面的四，5�10進行。
9、食品上霜和上頂用的混合物：
無菌操作稱取25g樣品，放入滅菌，帶螺旋帽的廣口瓶或其他合適的容器中。加入225mL營養(yǎng)肉湯并充分混合。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。振搖使其充分混勻，用試紙測定pH值。必要時，調節(jié)pH值至6.8±0.2。旋松瓶蓋約1/4轉后，置35℃培養(yǎng)24±2小時。以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
10、調味品：
A、黑胡椒、白胡椒、芹菜籽或者干辣椒粉、小茴香、紅辣椒、歐芹片、迷迷香、芝麻、麝香草、蔬菜片：無菌操作稱取25g樣品，放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶或其他合適的容器中。加入225mL滅菌胰酪胨大豆（TSB）肉湯，充分混勻，蓋緊瓶蓋于在室溫下靜置60分鐘。旋動混勻，用試紙測定pH值。必要時，調節(jié)pH值至6.8±0.2。旋松瓶蓋約1/4轉后，置35℃培養(yǎng)24±2小時。以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
B、洋蔥片、洋蔥粉、大蒜片：無菌操作稱取25g樣品，放入滅菌帶螺旋帽的廣口瓶或其他合適的容器中。將樣品于含K2SO3的TSB胰酪胨大豆肉湯（1000mLTSB加5g K2SO3使K2SO3的最終的濃度為0.5%）中進行前增菌。添加K2SO3于肉湯中。分裝225mL于500mL錐形瓶中，經(jīng)121℃高壓滅菌15分鐘。滅菌后無菌操作測定容量，必要時再調整至225mL。將225mL含K2SO3的無菌TSB加入樣品中，充分混勻。接下去按三，10A節(jié)進行。
C、牙買加胡椒、桂皮、丁香及薄荷：目前還沒有方法可以中和這四種香料的毒性。將香料稀釋至無毒的程度，再進行菌檢。檢驗牙買加胡椒，桂皮和薄荷時，樣品與肉湯比例為1∶100，而丁麝香樣品與肉湯比例為1∶1000。檢查葉狀的調味品，因遇到脫水的制品，可吸收肉湯這一實際困難，其樣品與肉湯比例要大于1∶10。檢查這些調味品按三，10A描述的方法進行，保持推薦的樣品與肉湯的比例。
11、糖果與糖衣（包括巧克力）：
無菌操作稱取25g樣品放入滅菌的攪拌容器中。加入225mL滅菌的調配脫脂乳粉，攪拌2分鐘。再無菌操作轉移攪拌過的混合物到滅菌帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。轉動混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。再加入0.45mL1%煌綠染液混勻，將瓶蓋旋松1/4轉后培養(yǎng)。以下按四，1�10節(jié)進行。
12、椰子：
無菌操作稱取25g樣品放入滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。加入225mL滅菌的乳糖肉湯，振搖后，蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘，再振搖使其充分混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。總計加入2.25mL已蒸過（15分鐘）的陰離子特吉托爾7號，并充分混勻。可用已蒸過（15分鐘）的三硝基甲苯X�100來代替。這些表面活性劑限制使用最小量，使之剛剛起泡沫即可。三硝基甲苯X�100大約2或3滴。旋松瓶蓋約1/4轉后，置35℃培養(yǎng)24±2小時。以下步驟按四，1-10繼續(xù)。
13、食用染料與食用色素：
pH6.0或以上的染料（10%懸浮液），按上述干全蛋方法（C�1）處理。沉淀染料或pH低于6.0的染料，無菌操作稱取25g樣品，放入滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。加入225mL不含煌綠染料的四硫磺酸鹽肉湯混勻。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘，用pH計調節(jié)pH值至6.8±0.2。再加入2.25mL0.1%的煌綠溶液，充分旋動混勻。旋松瓶蓋約1/4轉后，置35℃培養(yǎng)24±2小時。接下去按下面的四，3�10節(jié)進行。
14、明膠：
無菌操作稱取25g樣品，放入滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。加入225mL滅菌的乳糖肉湯和5mL5%明膠酶水溶液。混合均勻，蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。轉動混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。將瓶蓋旋松1/4轉，置35℃培養(yǎng)24±2小時。以下按四，1�10節(jié)進行。
15、肉、肉代用品、肉副產(chǎn)品、動物產(chǎn)品、腺體制品和粗粉（魚，肉，骨）：
無菌操作稱取25g樣品放入滅菌的攪拌器中。加入225mL滅菌的乳糖肉湯，攪拌2分鐘。再無菌操作轉移已攪拌的混合物到滅菌的帶螺旋帽的500mL廣口瓶中或其他合適的容器內。蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。如果混合物為粉狀，研磨過或已粉碎的，則不用攪拌。不需要攪拌的樣品，加入乳糖肉湯，并充分混勻；蓋緊瓶蓋在室溫下靜置60分鐘。旋動使充分混勻，用試紙測定pH值。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。總計加入2.25mL已蒸過（15分鐘）的特吉托爾陰離子7號，混勻。也可用已蒸過（15分鐘）的三硝基甲苯X�100來代替。控制使用這些表面活性劑劑量，剛剛起泡沫即可。實際用量取決于試驗材料的成分；分析粉狀腺體制品，不需要用表面活性劑。將瓶蓋旋松1/4轉后，將樣品混合物置35℃培養(yǎng)24±2小時。以下按四，1�10節(jié)進行。
16、田雞腿（此方法用于國內的和國外的所有田雞腿檢驗）：
將15對田雞腿放入滅菌塑料袋內，并用滅菌乳糖肉湯浸沒。如果單個腿估計平均重在25g或以上，則只需檢查15對的每對中的一條腿。把袋放入大塑料燒杯內或其它合適的容器中，在機械蕩器上震蕩15min，以4cm（1-1/2in）機械振蕩100次/分鐘。從袋中傾倒出乳糖肉湯于另一個滅菌塑料袋內。加更多的乳糖肉湯，使總量為3500mL。充分混勻，于室溫下靜置60分鐘。必要時調節(jié)pH值至6.8±0.2。再把裝有乳糖肉湯的塑料袋放入塑料燒杯或其它合適的容器內，于35℃培養(yǎng)24±2小時。接下去按下面的四，1�10節(jié)進行。
17、野兔骨架（此方法用于國內的和國外的所有的野兔骨架）：
取3只野兔骨架放入滅菌塑料袋內，并用滅菌乳糖肉湯浸沒（見上述A，23�25節(jié)），把袋放入大塑料燒杯內或其它合適的容器中，在機械震蕩器上以4cm（1-1/2in）幅度振蕩100次/分鐘，震蕩15min。從袋中傾倒出乳糖肉湯混合物于另一個滅菌塑料袋內，加更多的乳糖肉湯，使總量為3500mL。充分混勻，于室溫靜置60分鐘。必要時用pH試紙調置6.8±0.2，于35℃培養(yǎng)24±2小時。接下去按下面的四，1�10節(jié)進行。
18、口香糖：
無菌操作稱取25g樣品到滅菌燒杯（250mL）或其他合適容器中。制備過濾除菌的1.0%纖維素酶溶液（加1g纖維素酶到99mL無菌水中），用0.45um膜過濾除菌，置于150mL瓶中。（纖維素酶溶液在2·-5℃可保存最長2周時間）。加入225mL無菌乳糖肉湯和2.25mL無菌1%纖維素酶溶液于500mL無菌帶螺旋蓋的廣口瓶或其他合適容器。用磁力攪拌器劇烈攪拌酶/肉湯混合物時，通過無菌玻璃漏斗迅速倒入25g待檢樣品。旋好瓶蓋，室溫下靜置60分鐘，無須調pH值。旋松瓶蓋，35℃培養(yǎng)24±2小時。以下按四進行。
四、沙門氏菌的分離
1、擰緊瓶蓋并輕輕振蕩培養(yǎng)過的樣品混合物。
生鮮食物、嚴重污染的食品和動物飼料：
轉移0.1mL混合物到10mLRAPPAPORT�VASSILIADIS（RV）肉湯培養(yǎng)基中，另轉移1mL混合物到10mL四硫磺酸鹽肉湯（TT）中。
其它食品：
轉移1mL混合物到10mL亞硒酸鹽胱氨酸肉湯（SC）中，另轉移1mL混合物到10mL四硫磺酸鹽肉湯（TT）中。
2、選擇性增菌按如下步驟進行：
生鮮食品、嚴重污染的食品和動物飼料：
RV培養(yǎng)基在42±0.2℃（水溶）中培養(yǎng)24±2小時。TT肉湯在43±0.2℃（水溶）中培養(yǎng)24±2小時。
其它食品：
SC和TT肉湯在35℃培養(yǎng)24±2小時。
3、混合均勻（如果是試管，渦旋式混合），用3mm直徑的接種環(huán)，滿環(huán)（10μl）劃線接種TT肉湯于亞硫酸鉍（BS）瓊脂，木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂和HEKTOEN氏腸道菌（HE）瓊脂平板上。BS瓊脂平板于劃線接種的前一天制備好儲存在室溫暗處。
4、再用3mm直徑的接種環(huán)， 從RV培養(yǎng)基（樣品為生鮮食物，嚴重污染的食品和動物飼料）和SC肉湯（除了生鮮食物，嚴重污染的食品和動物飼料以外其它樣品）取滿環(huán)（10μl），劃線接種于上述平板上。
5、把選擇性平板置35℃培養(yǎng)24±2小時。
6、檢查平板中可疑沙門氏菌菌落的存在。
典型的沙門氏菌菌落形態(tài)：
從每個經(jīng)過24±2小時培養(yǎng)后選擇性平板上挑 取2個或更多個菌落。典型的沙門氏菌菌落如下：
A、在HEKTOEN氏腸道菌（HE）瓊脂上。
菌落呈蘭綠至蘭色，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈現(xiàn)大的光澤黑色中心或幾乎全部黑色的菌落。
B、在木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂上。
粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可有大的光澤黑色中心或呈幾乎全部黑色的菌落。
C、亞硫酸鉍（BS）瓊脂上。
呈褐色，灰色或黑色，有時帶有金屬光澤。菌落周圍的培養(yǎng)基通常開始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時間的延長而變?yōu)楹谏⒂兴^的暈環(huán)效應。
如果典型菌落出現(xiàn)在經(jīng)24±2小時培養(yǎng)后的BS瓊脂上，則挑取2個或更多個典型菌落。不論BS瓊脂平板在培養(yǎng)24±2小時時是否挑取過菌落，BS平板再培養(yǎng)24±2小時。培養(yǎng)了48±2小時后，如果BS平板上出現(xiàn)典型菌，則挑取2個或更多個菌落，如果只在經(jīng)過24±2小時培養(yǎng)的BS平板上挑取了菌落，接種到三糖鐵瓊脂（TSI）和賴氨酸瓊脂（LIA）上，會呈現(xiàn)非典型反應以至視為培養(yǎng)物中不存在沙門氏菌 。參見下面四.8部分和四.9部分，有關TSI和LIA反應的詳細描述。
非典型的沙門氏菌菌落形態(tài)：
不存在典型的或可疑的沙門氏菌菌落時，按如下步驟檢驗非典型的沙門氏菌菌落。
A、HE和XLD瓊脂：
非典型的沙門氏菌在HE和XLD瓊脂上呈黃色菌落，帶或不帶黑色中心。HE和XLD平板經(jīng)24±2小時培養(yǎng)后，沒有典型的沙門氏菌菌落，則挑取2個或更多個非典型的沙門氏菌菌落。
B、BS瓊脂：
某些非典型菌株產(chǎn)生綠色菌落，其周圍培養(yǎng)基稍微或不呈暗色。如果BS平板培養(yǎng)24±2小時后，沒有出現(xiàn)典型菌落，則不挑取任何菌落，讓平板繼續(xù)培養(yǎng)24±2小時。如果經(jīng)48±2小時培養(yǎng)后，仍沒有典型或可疑的菌落出現(xiàn)，則挑取2個或更多個非典型的菌落。
7、用滅菌接種針輕輕地接觸每個菌落中心部位，接種TSI斜面，先在斜面上劃線，再于底層穿刺。不需灼燒接種針，即可接種LIA斜面，先穿刺接種底層兩次，再劃線斜面上。由于賴氨酸脫羧反應需嚴格厭氧條件，因而LIA斜面必須有深的底層（4cm）。將已挑過菌落的選擇性平板于5�8℃儲存。
8、將TSI和LIA瓊脂斜面于35℃分別培養(yǎng)24±2小時。當進行斜面培養(yǎng)時放松試管帽以保持需氧條件，以防止過量的H2S產(chǎn)生。
在TSI瓊脂中，典型的沙門氏菌培養(yǎng)物使斜面呈堿性（紅色），底層呈酸性（黃色），產(chǎn)生或不產(chǎn)生H2S（瓊脂變黑色）。在LIA瓊脂中，典型的沙門氏菌培養(yǎng)物其試管底層呈堿性（紫色）反應。只有試管底層呈明顯黃色時才認為有酸性（陰性）反應。不要單純根據(jù)其試管底層產(chǎn)生的褪色反應就排除它。在LIA中，大多數(shù)沙門氏菌培養(yǎng)物皆產(chǎn)生H2S；一些非沙門氏菌培養(yǎng)物產(chǎn)生磚紅色反應。
9、在LIA瓊脂上所有底層呈堿性反應的培養(yǎng)物，無論其在TSI瓊脂上反應如何，皆應全部保留為可疑的沙門氏菌分離物，并進一步做生化和血清學試驗。在LIA中呈酸性底層反應和在TSI中呈斜面堿性，底層酸性的培養(yǎng)物，均視為可疑的沙門氏菌分離物，應進一步做生化和血清學試驗。在LIA中呈酸性底層和在TSI中呈酸性斜面和酸性底層的培養(yǎng)物，可視為非沙門氏菌培養(yǎng)物而棄去。對所保留的擬定陽性TIS瓊脂培養(yǎng)物，可按下面四，10節(jié)敘述的進行檢測，是否為沙門氏菌，包括亞利桑那沙門氏菌。如果TSI中培養(yǎng)物沒有呈現(xiàn)沙門氏菌的典型反應（斜面堿性，底層酸性），再從未擬定陽性的選擇性平板上另外挑取可疑菌落，象上面四，7節(jié)所述的接種TSI和LIA斜面。
10、生化和血清學鑒定試驗：
a從亞硒酸鹽胱氨酸肉湯（或相應食品的RV培養(yǎng)基）劃線分離的選擇性瓊脂平板上所挑取的3個擬定陽性TSI瓊脂培養(yǎng)物和從四硫磺酸鹽肉湯劃線分離的選擇性平板所挑取的3個擬定陽性TSI瓊脂培養(yǎng)物，進行生化和血清學鑒定試驗。
b如從一組選擇性瓊脂平板未分離出3個擬定陽性的TSI瓊脂培養(yǎng)物，則對其它已分離到的擬定陽性的TSI瓊脂培養(yǎng)物進行生化和血清學鑒定試驗。對所分析的每個25g樣品，至少應檢查6個TSI培養(yǎng)物。
五、沙門氏菌的鑒定：
1、混雜培養(yǎng)物：
對呈混雜菌的TSI瓊脂培養(yǎng)物，皆應劃線接種于麥康凱（MC）瓊脂，HE瓊脂，或木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂上，于35℃培養(yǎng)24±2小時。檢查平板上可疑沙門氏菌存在與否。
a、在麥康凱（MC）瓊脂上：
典型菌落呈透明、無色，有時帶有暗色中心。沙門氏菌菌落有時可使培養(yǎng)基中其它細菌所造成的膽鹽沉淀區(qū)透明。
b、在Hektoen氏腸道菌（HE）瓊脂上：見上述四，6a。
c、在木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂上：見上述四，6b。
按上面的四，6節(jié)所述轉種至少2個可疑沙門氏菌菌落到TSI瓊脂和LIA瓊脂斜面上，接下去按上述的四，8節(jié)進行鑒定。
2、純培養(yǎng)物：
a、尿素酶試驗（常規(guī)）。由每個擬定陽性TSI瓊脂斜面培養(yǎng)物，用滅菌針分別接種生長物到每個尿素肉湯試管中。偶爾也會有未接種的尿素肉湯管變紫紅色（試驗陽性），因而應包括未接種該肉湯管作為對照，于35℃培養(yǎng)24±2小時。
b、可選的尿素酶試驗（快速法）。用3mm直徑接種環(huán)，自每一擬定陽性的TSI瓊脂斜面培養(yǎng)物中取2環(huán)轉種到快速尿素肉湯管中，37±0.5℃水浴中培養(yǎng)2小時。棄去所有呈陽性結果的培養(yǎng)物，保留所有陰性反應的（培養(yǎng)基不變色）培養(yǎng)物，為進一步研究試驗用。
3、血清學多價鞭毛（H）試驗：
a、此時或以后進行多價鞭毛（H）試驗，可按下面五，4節(jié)所述進行。從每個尿素酶陰性的TSI瓊脂斜面培養(yǎng)物接種到以下任一項， 1）腦心浸液肉湯，于35℃培養(yǎng)4�6小時，直到可見的生長物出現(xiàn)（供當日試驗用），或2）胰胳胨大豆肉湯，于35℃培養(yǎng)24±2小時（供次日試驗用）。在各5mL肉湯培養(yǎng)物中加2.5mL甲醛生理鹽水溶液。
b、選兩個以甲醛處理的肉湯培養(yǎng)物同沙門氏菌多價鞭毛（H）抗血清試驗。在10×75mm或13×100mm血清學試管內，加入0.5mL經(jīng)合適稀釋的沙門氏菌多價鞭毛（H）抗血清，再加入0.5mL待測抗原進行試驗。并以0.5mL甲醛生理鹽水溶液同0.5mL甲醛處理的抗原混合好，制成鹽水對照，將各混合物于48�50℃水浴培養(yǎng)，每隔15分鐘觀察一次初步結果，并于1小時讀數(shù)最終結果。
陽性反應：在甲醛肉湯培養(yǎng)物與血清混合物中凝集，而在甲醛肉湯培養(yǎng)物與甲醛鹽水管中（對照管）不凝集。
陰性反應：在甲醛肉湯培養(yǎng)物與血清混合物中（試驗混合物）不凝集，在對照管中也不凝集。
非特異反應：在試驗混合物與對照管中皆出現(xiàn)凝集。對出現(xiàn)這類結果的培養(yǎng)物，需用“Spicer Edwars”氏抗血清做進一步試驗。
4、尿素酶陰性培養(yǎng)物試驗：
a、賴氨酸脫羧酶肉湯。如果所做的LIA試驗是滿意的，則不需重復試驗。如果培養(yǎng)物呈現(xiàn)可疑的LIA反應，則以賴氨酸脫羧酶肉湯進行賴氨酸脫羧酶的最終鑒定。將少量可疑沙門氏菌陽性TSI瓊脂斜面培養(yǎng)物接種至賴氨酸脫羧酶肉湯管。將試管帽旋緊，置于35℃培養(yǎng)48±2小時，至少每隔24小時檢查一次。沙門氏菌因堿性反應，則使整個培養(yǎng)基呈紫色。陰性反應則使整個培養(yǎng)基呈黃色。如果培養(yǎng)基出現(xiàn)褪色現(xiàn)象（即不呈紫色也不呈黃色），可加入幾滴0.2%溴甲酚紫溶液，然后再觀察試管的反應。
b、酚紅衛(wèi)茅醇肉湯或含有0.5%衛(wèi)茅醇的紫色肉湯基礎液。由TSI瓊脂上取少量培養(yǎng)物接種至肉湯管中。將試管帽放松。置于35℃培養(yǎng)48±2小時，但24h后觀察反應。大多數(shù)沙門氏菌呈陽性實驗結果，表現(xiàn)為內部發(fā)酵管中產(chǎn)氣和培養(yǎng)基變酸（黃色）。產(chǎn)酸為陽性反應。陰性反應為倒管內無氣體產(chǎn)生。整個培養(yǎng)基呈紅色（有酚紅指示劑）或紫色（有溴甲酚紫指示劑）。
c、胰蛋白胨（或色氨酸）肉湯。將少量TSI瓊脂培養(yǎng)物接種到肉湯管中，置35℃培養(yǎng)24±2小時，并按以下進行試驗。
1)氰化鉀（KCN）肉湯。
從24h色氨酸培養(yǎng)物移取3mm接種環(huán)一環(huán)轉種到KCN肉湯管中。將管口加熱，以便加塞時蠟封良好。35℃培養(yǎng)48±2小時，但24h后觀察反應。有生長者（有渾濁）為陽性。大多數(shù)沙門氏菌在此培養(yǎng)基中不能生長，即無渾濁現(xiàn)象。
2)丙二酸鹽肉湯：
用3mm接種環(huán)移取24h色氨酸肉湯培養(yǎng)物，轉種到丙二酸鹽肉湯管中。因偶爾會出現(xiàn)未接種的丙二酸鹽肉湯在存放期間變蘭（陽性反應），所以應有未接種的丙二酸鹽肉湯管作對照。35℃培養(yǎng)48±2小時，但在培養(yǎng)24h后觀察反應。大多數(shù)沙門氏菌培養(yǎng)物在此肉湯中為陰性反應（綠色或不變色）。
3)吲哚試驗：
轉種5mL24h色氨酸肉湯培養(yǎng)物到空試管中，加入0.2-0.3mLKovacs氏試劑，大多數(shù)沙門氏菌培養(yǎng)物為陰性反應（在肉湯表面無深紅色）。并記錄呈桔色和粉色變化的中間型為±反應。
4)沙門氏菌血清學鞭毛（H）試驗：
如果未做多價鞭毛（H）試驗或Spicer-Edwards氏鞭毛（H）試驗，可任選其一。
5)吲哚試驗陽性和血清學鞭毛（H）試驗陰性；或者KCN試驗陽性和賴氨酸脫羧酶試驗陰性的非沙門氏菌任一培養(yǎng)物予以去除。
5、沙門氏菌血清學菌體（O）試驗。（用已知沙門氏菌培養(yǎng)物同所有抗血清做予試驗）。
a、多價菌體（O）試驗：
用蠟筆在每個玻璃或塑料平板（15×100mm）內側劃出2個約1×2cm的區(qū)域。可使用商品化的分區(qū)載玻片，用2mL0.85%生理鹽水乳化從24-48hTSI斜面或者更好是胰胨血瓊脂基礎（無血），用3mm接種環(huán)移取培養(yǎng)物。加1滴菌懸液于用蠟筆標出的每一矩形區(qū)域的上部。這一區(qū)域的下部加1滴生理鹽水。在另一區(qū)域加1滴沙門氏菌多價菌體（O）抗血清。再以干凈滅菌的接種環(huán)或針將一個區(qū)域內的菌懸液和生理鹽水混合。在另一區(qū)域內菌懸液和抗血清液混合。將混合液前后傾斜移動1min，并在良好照明下對著黑暗背景觀察，任何程度的凝集都視為陽性反應。多價菌體（O）試驗結果分類如下：
陽性反應：混合物試驗凝集，而在鹽水對照中不凝集。
陰性反應：混合物試驗不凝集，在鹽水對照中也不凝集。
非特異性反應：混合物試驗和鹽水對照中皆凝集，需按Edwards和Ewing氏的腸桿菌科鑒定中所描述的進一步作生化學和血清學試驗。
b、菌體(O)群試驗
如有各群菌體（O）抗血清，包括Vi，代替沙門氏菌多價菌體（O）抗血清，按上述五，5a試驗。對Vi凝集反應陽性的可參照官方分析分析方法的967.28B部分專門處理這些培養(yǎng)物。與菌體（O）群抗血清呈陽性凝集的培養(yǎng)物，作該菌體（O）群陽性記錄；不能與菌體（O）群抗血清發(fā)生反應者，做該菌體（O）群試驗陰性記錄。
6、補充生化試驗
按表1中1-11項試驗，對培養(yǎng)物呈典型沙門氏菌反應者，進行沙門氏菌分類。如在25g分析樣品中有一個TSI培養(yǎng)物被劃為沙門氏菌，則該25g分析樣品的其他TSI培養(yǎng)物就無需進一步試驗。沙門氏菌鞭毛（H）試驗陽性表明有沙門氏菌抗原，但不具有沙門氏菌生化特性者，應對培養(yǎng)物作純分離（按上述五、1），按上述五、2開始重新做試驗。
對表1中1-11項目，不呈典型沙門氏菌反應的培養(yǎng)物做以下補充試驗以最終判斷為非沙門氏菌。
a、酚紅乳糖肉湯或紫色乳糖肉湯。
1)從每個尚未分類的24-48hTSI瓊脂斜面上挑取少許培養(yǎng)物，接種到肉湯管中，35℃培養(yǎng)48±2h。并在24h后開始觀察變化。
陽性反應：產(chǎn)酸（黃色）和在倒立發(fā)酵管內產(chǎn)氣。只要產(chǎn)酸就視為陽性反應。大多數(shù)沙門氏菌為陰性結果。即在倒立發(fā)酵管內沒有氣體形成，和整個培養(yǎng)基呈紅色（含酚紅指示劑）或紫色（含溴甲酚紫指示劑）。
2)除培養(yǎng)物在TSI瓊脂斜面上產(chǎn)酸和在LIA中呈陽性反應，或丙二酸鹽肉湯試驗呈陽性的培養(yǎng)物外，棄去乳糖試驗陽性的非沙門氏菌培養(yǎng)物。為了證明他們是否為亞利桑那菌，需對這些培養(yǎng)物作進一步試驗。
b、酚紅蔗糖肉湯或紫色蔗糖肉湯。
按上述五,6a-1所敘述的程序進行，除那些培養(yǎng)物在TSI瓊脂斜面上產(chǎn)酸和在LIA中呈陽性反應者外，呈蔗糖試驗陽性結果者皆作為非沙門氏菌棄去。
c、MR-VP肉湯。
對每個未分類的TSI瓊脂斜面上可疑沙門氏菌培養(yǎng)物，挑取少許，接種到此肉湯管中，置于35℃培養(yǎng)48±2h。
1)在室溫下按下述進行Voges-Proskauer氏(VP)試驗：
移取1mL48h培養(yǎng)物于試管中，并將剩余的MR-VP肉湯于35℃再培養(yǎng)48h。加入0.6mLα-萘酚溶液于試管中并振搖；加40%KOH溶液0.2mL，并振搖。為了加快反應速度，加少許肌酸結晶。4h后觀察結果：陽性反應為整個培養(yǎng)基由粉紅色轉變至紅寶石色。絕大多數(shù)沙門氏菌VP試驗陰性，即整個肉湯不呈粉紅至紅色變化。
2)甲基紅試驗：
吸取經(jīng)96h培養(yǎng)的MR-VP肉湯5mL于試管中，加入5-6滴甲基紅指示劑，立即觀察結果。絕大多數(shù)沙門氏菌培養(yǎng)物呈陽性結果，即培養(yǎng)基呈彌散性紅色。明顯的黃色為陰性結果。對KCN陽性，V-P試驗陽性及甲基紅試驗為陰性培養(yǎng)物，皆可作為非沙門氏菌棄去。
d、Simmons氏枸櫞酸鹽瓊脂：
從未分類的TSI瓊脂斜面上，用接種針沾取培養(yǎng)物，劃線接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，并穿刺底層。置于35℃培養(yǎng)96±2h，按下述方法讀取結果。
陽性反應：能生長，通常伴隨顏色由綠色變蘭色。大多數(shù)沙門氏菌培養(yǎng)物為枸櫞酸鹽陽性。
陰性反應：不生長或微弱生長，而且不變色。
7、培養(yǎng)物的分類：
沙門氏菌培養(yǎng)物應具有表1反應模式。凡培養(yǎng)物具有表2所列任何一小項結果，為非沙門氏菌則棄去。對任何培養(yǎng)物，當不能按表1的分類表，明確地鑒定為非沙門氏菌屬，或也不能根據(jù)表2所列試驗反應從沙門氏菌屬中排除者，可按Edwards和Ewings氏的“腸桿菌科鑒定”所述的補充試驗進一步分類。
如2個TSI培養(yǎng)物皆不能按生化試驗證實分離物為沙門氏菌時，則對同一個25g檢驗樣品中保留的尿素酶陰性TSI培養(yǎng)物，按五，4開始進行生化學試驗。
8、沙門氏菌屬的擬定性鑒定。
使用5種商品化的生物化學試劑盒（API 20E, Enterotube II, Enterobacter aceae II, MICRO-ID,或Vitek GNI）中任一種，代替常規(guī)的生化管系統(tǒng)，鑒定擬定食源性沙門氏菌屬。按本節(jié)鑒定所述，檢驗人員根據(jù)自己試驗室選擇商品試劑盒與生化管系統(tǒng)相適應的一種商品試劑盒。生化學商品試劑盒不能用來代替血清學試驗（1）。組裝試劑盒，配制試劑盒所需試劑。參照官方分析方法的978.24部分（API-20E, Enterotube II和Enterobacterlaceae II）,989.12部分（MICRO-ID）,和991.13部分（Vitek GNI）,接種于每個組合，并按規(guī)定的時間與溫度進行培養(yǎng)。加試劑，觀察與記錄結果。參照上述Ref.1把培養(yǎng)物擬定為沙門氏菌或非沙門氏菌屬。
為證實擬定為沙門氏菌的培養(yǎng)物，尚需進行沙門氏菌菌體（O）血清學試驗，按上述五，5；和沙門氏菌鞭毛（H）血清試驗，按上述五，3；或進行Spicer-Edwards氏鞭毛（H）試驗。并按下列原則對培養(yǎng)物進行分類：
a、用商品化試劑盒擬定為沙門氏菌的培養(yǎng)物，若沙門氏菌菌體（O）血清學試驗陽性與沙門氏菌鞭毛（H）血清學試驗陽性的則報告為沙門氏菌。
b、用商品化試劑盒確定為非沙門氏菌的培養(yǎng)物，參照AOAC標準（1）確定亦為非沙門氏菌，應作非沙門氏菌予以排除。
c、凡不符合a或b的培養(yǎng)物，應按上述五,2-6項中有關規(guī)定作進一步試驗，或按Ewing(2)氏的有關項目進一步試驗，或送至標準定型實驗室，做最后的血清定型與鑒定。
9、鞭毛（H）試驗陰性培養(yǎng)物的處理：
對一些生化反應典型，被認為是沙門氏菌，但鞭毛（H）試驗陰性的培養(yǎng)物，可能是無動力的菌株，或鞭毛抗原發(fā)育不充分，對此培養(yǎng)物的動力測定方法如下：
從TSI斜面上挑取少量的培養(yǎng)物，接種于動力試驗培養(yǎng)基平板中，在距平板邊緣10mm處一次穿刺2-3mm深，不要刺到平板底或接種到其他任何部位。置于35℃培養(yǎng)24h。如果細菌游散生長至40mm或更遠，按下述方法再試驗：在游散生長最遠處，用3mm接種環(huán)轉種一環(huán)培養(yǎng)物至胰酪胨大豆蛋白胨肉湯中。重復沙門氏菌多價鞭毛（H）（按上述五，3）或作Spicer-Edwards氏鞭毛（H）血清學試驗。如果培養(yǎng)物經(jīng)第一個24h培養(yǎng)后無動力，于35℃培養(yǎng)24h；如果仍無動力，則置25℃再培養(yǎng)5天。如果上述試驗仍為陰性，把該培養(yǎng)物定為無動力菌株。如果鞭毛（H）陰性培養(yǎng)物，按生化學反應可疑為沙門氏菌，應將培養(yǎng)物呈送微生物學實驗室作進一步的鑒定和/或血清學分型。遞送血清學定型培養(yǎng)物，除非另有說明，每個檢驗樣品要遞送兩個分離物。培養(yǎng)物要放在腦心浸液瓊脂斜面的試管內遞送。試管的螺旋帽應擰緊以確保安全。
六、控制：
嚴格執(zhí)行食品生產(chǎn)良好操作程序，注意滅蠅，加強對飲水、食品等的衛(wèi)生監(jiān)督管理，以切斷傳染途徑。對食品加工和飲食服務人員定期進行健康檢查，及時發(fā)現(xiàn)帶菌者并給以治療或調離工作崗位。加強屠宰業(yè)的衛(wèi)生監(jiān)督及各種食品特別是肉類運輸、加工、冷藏等方面的衛(wèi)生措施，防止沙門氏菌污染。
在食品加工過程中，必須嚴格按衛(wèi)生規(guī)范防止二次污染，通過蒸煮、巴氏消毒、存放適宜溫度等進行控制，都能防止沙門氏菌病的發(fā)生。
