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51.通常我們在分析天然藥物成分的時候結構復雜，無法考察組分的PKa值，哪我們如何去選擇最合適的流動相或者是拖尾該怎么改善呢？
答：如果天然產物中沒有易電離的極性基團，就不需要用緩沖鹽調節pH。如果，天然產物中既有酸性基團，也有堿性基團，譬如，有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的兩性物質，建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4（如果是，諸如月旭的Ultimate LP-C18這樣的耐酸色譜柱，還可以調得更低）。
如果pH控制在6.2～9.0之間，兩個基團都處于離子態，保留能力最差，是最不可取的。如果不清楚復雜物質中含有什么基團，也請將pH調到2.4或更低。因為pH調低，起碼抑制了酸性基團的電離而處于中性分子狀態，而增加酸性基團這個部分在反相色譜中的保留能力；另外，低pH還抑制了硅醇基的活性，有利于獲取對稱的峰形。
情況不明時候，為什么不建議調高pH呢？一方面一般色譜柱都不能承受pH=9以上的條件；即使是像月旭的X-timate系列一樣能耐12.5的柱子，調高pH和調低pH相比，還有一個硅醇基活性大的劣勢。
52.記得以前拿到C18柱，會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，這樣做的目的是什么呢？是先用溶劑活化嗎？然后再用樣品？還有測定短肽總是沖出來，該怎么解決呢？就是和溶劑峰出在一起，或者出在溶劑峰之前。
答：C18柱，會用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，因為，色譜柱到達用戶手中時，時間長短不一，在存儲和運輸的過程中，可能存儲液有些揮發，低流速的甲醇可以很好的浸潤固定相，使鍵合相很好的伸展，用溶劑平衡好系統后，可以采取多次進樣或者加大進樣量的方式以更快的獲得重現的色譜圖，這樣用樣品將色譜柱中的活化點飽和，就不會出現異常色譜現象的情況。
53.C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環境中，會對柱子有什么損壞嗎？pH在2左右。
答：pH=2左右容易使鍵合在硅膠基質上的固定相水解流失，包括：C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對更容易水解。不知道你保存的酸性環境是不是含有緩沖鹽，如果，不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動相中，也不必過份擔心，最多相當于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧；有緩沖鹽就麻煩一點，保存期間水分揮發可能會導致緩沖鹽結晶在柱內析出，對柱子損傷很大。
54.色譜柱的安裝有什么技巧嗎？只要保證不漏就行了嗎？還有所謂的死體積怎么測定呢？
答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是完全不保留的物質出峰時從進樣到流過色譜柱的總體積，一般用極性非常強的尿嘧啶的出峰來測定。死體積包括柱體積（色譜柱內溶劑能占據的空腔體積）和柱外體積兩部分。
你從廠商這里買到色譜柱，柱體積已經是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進樣器內死體積、毛細管長度、毛細管和色譜柱連接緊湊與否，保護柱或在線濾器產生的死體積大小，都對這個有影響。樣品在柱內，除擴散外，還有和填料作用引起的組分分離；但樣品在柱外，那就只有擴散這個使柱效下降的因素了。所以，要取得好的分離效率，柱外體積應該是越小越好。
峰有時候前延，有時候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關鍵就是色譜條件的選擇。包括進樣量、樣品溶劑、流動相組成（包括：添加劑）、流動相pH以及柱溫，都對峰形有影響。另外，測定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質，需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會不正常。所以最好把你具體的測定條件也列一下，也便于有針對性的分析原因。
55.測定多肽樣品時，十幾肽或者二十幾肽時，有時峰前延的比較厲害，有時峰拖尾比較厲害，這是什么原因呢？是樣品的問題還是柱子的問題？
答：峰有時候前延，有時候拖尾，一般不是色譜柱的問題，應該是樣品和色譜柱填料的作用問題，可以說如果色譜柱類型選擇沒問題，關鍵就是色譜條件的選擇，包括：進樣量、樣品溶劑、流動相組成（包括：添加劑）、流動相pH以及柱溫，都對峰形有影響，另外，測定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質，需要平衡時間越長。如果柱子沒平衡好，峰形也可能會不正常。所以最好把你具體的測定條件也列一下，也便于有針對性的分析原因。
56.柱子的平衡時間跟填料關系大嗎？哪種最快，哪種最慢？因為我在做離子交換柱的時候平衡是相當的慢!
答：根據色譜速率理論，粒徑越小，柱效越高，而且當粒徑小到亞2微米左右時，線速度的提高，其分離度就不再降低，從而，改變了許久以來人們不得不在 “速度和分離度之間取舍”的局面。
57.關于配置流動相，有機相我們可以甲醇乙腈同時用，這個是基于什么考慮的？是不是根據甲醇乙腈選擇性不同、樣品在這個兩者的溶解度的差異以及調節洗流動相脫能力來考慮的？
答：甲醇和乙腈同時用，可以獲得單純的甲醇或者乙腈不一樣的選擇性，而且洗脫能力也會改變，根據多元流動相的強度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb純溶劑a和b的溶劑強度因素；ψa、ψb分別為a和b的體積分數，所以，在藥典中有很多體系都使用甲醇乙腈體系。
58.三乙胺磷酸鹽緩沖液作流動相，柱壓一天比一天高，該怎么樣解決？
答：把柱子再生下，再生的方法搜一下有很多反沖對絕大部分色譜柱都是可行的，效果不錯。
59.新出廠液相色譜柱，保護溶劑一般是什么？怎樣進行平衡清洗比較好，一般要平衡多長時間比較好？
答：柱子類型不同，保存溶劑也會不一樣吧，具體要看說明書的說明。對于反相柱，一般用甲醇（乙腈）保存，也有用80%左右甲醇濃度的甲醇/水保存的。一般用流動相平衡沖洗10～20個柱體積即可。（注意：柱體積不等于空柱管體積，4.6×250mm的色譜柱空柱管體積是4.15mL，而柱體積只有約2.5mL）
60.據說液相色譜柱柱壓達到一定高度就不能使用了，請問一般達到多高，用甲醇和乙腈是不是不一樣？
答：柱壓不是色譜柱不能使用的唯一因素，分離度才是最重要的。柱壓只要沒高到儀器不能承受的地步，例如，超過300bar，就可以一直使用。甲醇的粘度比乙腈高，同樣狀況的柱子，如果用甲醇做流動相，柱壓可能超了，換用乙腈會使柱壓下降不少，儀器還能承受。不過盡管柱壓還沒上升到接近400Bar的限定，如果，發現柱壓上升速度較快，也需要及早對柱子進行清洗維護，從根本上排除導致柱壓上升的源頭。
61.柱塞板可不可拆下用超聲波清洗，會有什么不良后果？
答：不建議將柱篩板拆下清洗，因為，拆下承壓的柱篩板會導致柱床發生變化，影響色譜性能。應該對污染的色譜柱先進行清洗維護，維護沒有效果，再把拆洗柱篩板作為最后的手段。
62.一般正常使用一個C18柱能用多長時間？
答：柱壽命一般不按時間計算，按持續進樣針數比較科學。一般正常使用維護，不超過pH和溫度等范圍，C18柱能達到500～2000針進樣的壽命，視樣品干凈程度的不同而不同。
63.超高壓快速高分離度色譜柱是不是未來液相色譜柱普及應用的一個發展趨勢？
答：這是個大話題，今后使用，會越來越多是肯定的，但是否會替代普通壓力的液相還有爭議。超高壓也有使用上的不便，譬如容易堵，對設備硬件要求高等。有機會我再談談超高壓液相色譜方面詳細的一些情況。
64.如果液相色譜譜圖基線漂移很大是不是柱子的問題？波長越小的越大，270nm的還不怎么能看出來，230nm的就非常厲害了，有可能是什么原因造成的？
答：有可能是你的流動相的問題，230可能已經快到你流動相的截止波長了，當然，紫外吸收強，基線漂移厲害。
65.我們有一臺waters1525色譜儀，最近基線總是呈現波浪形很有規律，波長越小越明顯，梯度洗脫時向上飄逸而且后一段時間呈現波浪形，很影響分析，我想問一下，是不是柱子的原因，用的是C18上海安普的？
答：應該是流動相組成變引起吸收本底變化造成的，特別是在波長小的時候，乙腈的截止波長低于200nm，但甲醇和水相對比較高，在低波長時，甲醇和水有一定的本底吸收。梯度進行時，隨著不同本底的組分含量的變化，基線也會有相應的波動。
66.我是做農藥殘留分析的，用的是UV2487檢測器，想問一下，C18色譜柱用什么緩沖液比較好，我以前做三聚氰胺是用檸檬酸，辛烷磺酸鈉，也用農藥檢測行不行？還有用HLB柱能不能去除蔬菜和水果中的雜質？
答：C18色譜柱用用磷酸鹽，醋酸鹽就比較好啊，離子對試劑不是個好東東，你要慎用。我們做三聚氰胺用三氯乙酸。
67.液相色譜柱一般使用壽命多長？不同類型的色譜柱是否壽命也不一樣？液相色譜柱與氣相的柱子有何區別呢？
答：液相色譜柱一般使用壽命多長！我有一根柱子，用了大約1年半左右，發現同樣濃度的樣品它的峰展寬了。說明柱效下降。但是不影響結果。因為峰面積還是接近。所以做色譜之前先做下柱子性能測試。第一次的圖譜要保留。 測試C18RP柱，一般用到萘作為柱子的柱效判斷。一般是18000片，對稱性（usp）0.95～1.05間。
68.①“水相”指的是什么？純水？②我們實驗室的CN基柱保存在40%的乙腈里面，這個有不良后果嗎？
答：水相就是純水。CN基不適合保存在中等極性的溶劑中，除了可以低溫保存在極性較大的純水中外，還有可以保存在非極性溶劑如正己烷中。40%乙腈水，屬于中等極性溶劑，短期過夜保存可能問題不大，長期保存不太好，后果就是可能會發生柱床坍塌。
69.CN基柱應該怎樣維護才好呢？比如，做完實驗用什么流動相沖柱子、短期用什么溶劑保存、長期用什么溶劑保存等。
答：CN可作正相柱，也可作反相柱用，除了保存溶劑有特殊要求外，其它維護辦法和一般正相和反相柱沒有多大區別。
70.我們是waters的分析儀，用其他家的柱子可不可以？
答：你用Waters的儀器，而開始也用的是Waters柱子，如果是用不銹鋼接頭，匝扣的位置就固定了。如果用其他家的柱子，可以把固定匝扣位置的那段剪掉，換一個新的匝扣就可以重新固定匝扣位置。當然，如果你已換成peek接頭，問題就不會很大。
71.色譜柱的接頭，出口處用的是peek接頭，請問都用peek接頭不行么，為什么？
答：都用peek接頭我認為都可以的，當然，peek接頭的質量要過關。有人認為peek接頭不耐壓，估計是針對品質不好的產品說的。
72.我們的液相，為了節約成本我們自己填保護柱，用廢的同型號柱子填。但填完以后做標樣定量分析有所改變。請問其原因。
答：不建議自己填保護柱柱芯，填得不好的柱芯會影響分離效果，也會影響定量分析結果。你不知道廢柱子里的填料是不是受了污染，另外你填的柱芯肯定沒有廠商填得好，如果影響到峰形，峰面積積分結果有所改變是可能的。
73.請問怎么測柱效？（柱子填料是Sino Chrom ODS-BP 5μm，規格4.6mm×200mm）
答：測定柱效不同公司不一樣，有用甲苯，也有用萘的。一般柱子里面有檢測報告，你按照報告里的方法做一遍就可以。
74.我用苯試了一下，峰性大大好，但是，不知道理論塔板數，不知道怎么評價，感覺不大好，對稱性不好，有點前延，柱子才用了四個月，是什么原因呢？是不是塌陷了呢？有什么補救的辦法嗎？
答：用了四個月峰形拖尾是很正常的，需要維護清洗一下色譜柱以清除引起拖尾的柱頭污染。如果柱頭塌陷，則不好辦，從其它廢柱子里取點填料填補塌陷，可以一試，但效果不一定好。色譜柱是耗材，測定進樣針數如果達到500以上了，也算是物有所值，物盡其用了，報廢了也不可惜。
75.流動相里之前有酸的，做完后單純用乙腈沖洗，能把酸沖洗干凈嗎？之前，他們是這樣沖的，現在懷疑柱子塌陷了，會不會是長時間在酸性環境中造成的呢？
答：流動相里有酸，應該先用純水或80：20的水/乙腈溶劑沖洗吧。如果，一直在酸性環境，固定相容易流失，造成保留時間前移和其它色譜性能下降。
76.我前一段時間做三聚氰胺用C18色譜響應值很小，幾乎無法檢測，可是檢測標準就是用的C18，后來我用RP18結果響應值很好，不知道什么原因，請問這兩個柱子不都是反相色譜柱么？他倆之間有什么不同？
答：RP18就是C18吧，不過C18柱之間也有區別，測定三聚氰胺一般要用極性比較大的水性C18柱。
77.磺化交聯的苯乙烯-二乙烯基共聚物為填充劑的色譜柱在儲存過程未注意放在冰箱中，導致發霉后，柱效急劇下降，能何種方法將此色譜柱修復好？
答：聚合物柱子因為不怕酸堿，就直接用強酸強堿清洗。如果是H型，用1M硫酸沖洗；如果是Ca型，可以先用1M硫酸沖洗，再用EDTA鈣鹽轉換回Ca型柱；如果是中性的聚合物反相柱，直接用1M的NaOH沖洗。
78.我有一個標準的穩定性檢測分析方法它是建立在某一供應商的碳18柱上我知道有另一個廠家生產同樣的碳18柱但價錢是它的一半如果我更換柱子會不會影響到分析方法。。。
答：要看這一分析方法的具體要求。如果方法中有說明“使用某一色譜柱或與其同樣的柱子，”那么，就可以使用別的柱子來替換。但要注意，不能光看一個柱子標為碳18柱，或是其宣傳等價于某某柱，就認為該柱適用于所有方法。必須要驗證色譜柱的等價性。
我們需要考查使用新柱子時，系統適應性是否可以通過驗證。如果可以獲得系統適用性測試中所要求的保留值，分離度以及其它參數等，就可以使用該柱。推薦使用系統適用性測試樣品以及其它的典型樣品來進行考查，以保證雜質和降解物在正確的保留時間出峰并給出正確的濃度響應；并且在新柱子上獲得的分析結果要等價于在原柱子上的結果。
79.請問我做一種藥的分析查美國藥典規定使用100mm×40mm，8μm的色譜柱流速3mL/min可現在市場上已不容易找到這種規格的產品于是我按USP中色譜柱比較的數據庫的指引選了一款選擇性一致的等價色譜柱其規格是100mm×46mm，3μm的色譜柱當選用3mL/min的流速時發現柱壓超高請問我如何對方法進行調整以滿足USP的要求？
答：流速調整原則是流動相通過柱子的線速度一致，等價柱的截面積大了，流速也應增加才能保持相同的線速度。新流速計算結果是：（4.6/4.0）2×3.0=4.0mL/min。但3mL/min流速都已導致柱壓太高，4.0mL/min明顯不行。好在USP還有個允許±50%的流速調整指導原則，這樣將流速調至2.0mL/min既符合USP規定，又能使柱壓降到可接受的范圍，但這種改變不能引起其它不好后果。
這個例子中，等度分析中，流速改變會引起塔板數和峰寬的改變，但不會影響峰的選擇性。3μm粒徑色譜柱柱效比8μm的高很多，可考慮縮短柱長以補償或部分補償流速降低造成的測定時間增加。所以，更佳選擇是50mm×4.6mm，3μm的柱子，2.0ml/min的流速運行，可以在符合USP規定的情況下，又得到更快速的測定分離。
80.最近我非常的沮喪，按照藥典上的色譜條件和方法做某藥物的分析，卻始終得不到滿意的結果。有人建議我對色譜條件，如進樣量、流動相pH和溫度等，進行微調以得到良好的峰形和分離效果，可按公司規定我不能這樣做，怎么辦？
答：如果你心里老有這個思維定勢“按規定，我不能......”，然后什么也不敢做，那真是不好辦！只有去做了，去試著改變條件看看得到什么結果，你才能發現問題所在。如果改變條件后，仍得不到好結果，就要去找色譜條件以外的原因，如，色譜柱、色譜儀器以及樣品和制樣過程中的是否存在問題？不管通過微調你是否取得了好結果，你也有了向領導匯報問題和解決方案的依據。
而且，絕對不能調整藥典規定色譜條件的說法通常是不對的。美國藥典USP說的是如果改變藥典方法需要重新做方法驗證，但方法調整或者稱微調以符合系統適應性的要求是允許的，是不需要重新做方法驗證的。USP列了調整的幾條指導原則，如，±50%的流速調整，±10°C的溫度調節等等（詳見"Chapter621，Chromatography，”，UnitedStates Pharmacopeia No.31-NF 26，(2008).）。當然既然是指導原則，這些規定都不是絕對的，如溫度調整±10°C，對有些方法適用，對另外的方法則±5°C的調整都會有問題，我們應該依據具體情況作出明智的科學判斷。
81.請問下HibarRT250-4這個柱子很特殊么？為什么很多藥典中的藥物分離都用它做柱子，因為才開始做藥，不知道hi，bar的柱子特點是什么？
答：HibarRT250-4是Merk的一個品牌，不是很了解。大概是共用柱頭，可更換的柱管。
82.在堿性條件下硅膠溶解，又生成硅羥基的機理是什么？反應方程式如何寫？
答：二氧化硅溶解的反應式是：
SiO2+2OH-=Si032-+H2O或者表示成水解的形式：SiO2+H2O=Si032-+2H+
這說明硅膠會在堿性條件下溶解而生成硅酸根，但，我們這里說的是硅膠顆粒表面的部分溶解，含有鍵合固定相的硅膠原表面溶解脫落后，自然會生成新鮮的硅膠表面，而新鮮的硅膠表面結構一般都是含有硅羥基的。硅膠基本結構單元是Si-O-Si鍵，在OH-離子的作用下，Si-O鍵斷裂，在表面形成Si-O-H硅羥基的結構單元。
必須指出的是，在氨基柱的孔內，并沒有單獨加入OH-離子，偏堿小環境的形成是由于氨基易和水電離生成的氫陽離子結合造成的游離OH-離子的過剩。從第一個方程式角度解釋，游離的OH-離子用完，硅膠就不再繼續溶解；從第二個水解形式方程式角度解釋：當硅膠水解生成的H+離子足夠用來和氨基結合時，水解過程就會變慢或停止。
83.同樣都是C18柱子，液相色譜柱和SPE他們之間有什么區別，能具體講一下么？
答：HPLC柱子和SPE小柱的對比：
對比項目 HPLC SPE
柱管 不銹鋼管 塑料管
粒徑（um） 3，5，10 40-300
顆粒形狀 球形 一般為無定形
柱效（塔板數） 20-25000 <100
分離機理 連續洗脫 數字式開關洗脫
售價（元） 1000-4000 10-40
使用方式 可重復使用 一次性使用
操作成本 較高 低
設備成本 高 低
※對于C18固定相，為了提高回收率，SPE里用的C18填料一般載碳量相對更高。
84.我從上面了解到RP18和C18的區別是極性強一些，能問一下他們在分析農藥是可不可以通用？C18適用于那些農藥的分析？我查材料看到苯醚甲環唑都是用C18分析的，可我用C18分析發現響應值很小，沒法分析能幫忙分析一下原因么？
答：RP18和普通C18，肯定有其不同的適應性，農藥種類這么多，可能大部分農藥兩者都能用，有些就不一定。你問的C18適用于哪些農藥，應該從相關農藥分析方面的書籍手冊中可以查到具體什么農藥用什么色譜條件合適，其中里面肯定有選擇什么類型柱子，我這邊沒辦法一一列舉。液相色譜中，60%以上的分析物可以用C18柱，我想也應該有60%以上的農藥可以用C18柱。
如果手冊或文獻中查不到，你把農藥作為普通分析物來對待，然后按照一般的色譜柱選擇和方法建立原則來做就可以，選擇決定因素應該也是農藥分子的結構。苯醚甲環唑，應該含有極性基團，可以試試極性強的C18柱。
85.我在用乙腈作流動相時，只要那個乙腈比例稍高一點，比如，20%，即使，測量波長高于乙腈截止波長比較多，也會產生比較大的溶劑峰，這怎么回事？
答：如果出現溶劑峰，對你的分析結果沒任何影響，那就讓溶劑峰在那兒好了，或者你用規定的溶劑溶解提取樣品后，再用流動相稀釋一下樣品，如果，稀釋后檢測限能達到的話。
86.我在做一個模擬胃內容物中藥物反應試驗，需要動態測定某藥品含量變化。分析時碰到一個棘手問題，進樣量同樣用20μL，用對照品進樣時色譜峰形不錯，進樣品時卻一直不能得到好的峰形。后來分析是模擬胃內容物樣品的酸度過高的因素，可我通過稀釋的方法讓樣品酸度和流動相接近，雖然峰形沒問題了，卻發現因稀釋導致分析物在樣品中含量下降，低于最低檢測限了，如何是好呢？
答：稀釋很方便，但靈敏度更高的檢測器不容易找，不過還是有個簡單的解決方案。當用流動相稀釋樣品時，只要稀釋后樣品中有機相含量比流動相中的有機相比例低10個百分點以上（如，流動相中甲醇含量是40%，則樣品中甲醇含量一定要低于30%），樣品流動會被色譜柱進口端延緩或阻擋，稱為“柱上富集”。由于“柱上富集”作用的存在，這種情況下進行大體積樣品進樣，可避免樣品溶劑組成和流動相一樣時進樣量過大產生的“峰展寬”。針對你提的這個實例，可用稀的NaOH溶液調節樣品pH和流動相匹配，并將樣品最終稀釋一倍。將進樣量提高一倍到40μL，就可達到最低檢測限的要求。
87.峰形后拖尾是什么原因造成的？
答：
[柱物理損壞]
色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。唯一的解決方法就是更換新柱。
[柱內填料污染]
流動相和樣品中的雜質是色譜柱主要污染源。
流動相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純試劑。流動相所用的水最好是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45μm溶劑微孔過濾（器）過濾，除去可能存在的微粒。流動相建議現用現配，對于含鹽的溶液尤其注意長置會產生細菌或出現沉淀。此外還得保證儲存流動相的容器清潔。
復雜樣品可選用0.45μm溶劑微孔過濾（器）或樣品預處理柱對樣品進行預處理，確保樣品中不含微粒雜質。若樣品不便處理，要使用保護柱。柱內填料污染時，可將柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出柱內前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復，或以能溶解污染物的流動相按色譜柱使用的相反方向，沖洗色譜柱（約20至30倍柱體積，或視具體情況而定；另外，此時不能接檢測器），將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標明的使用方向使用。
[柱進口處有異物]
當斷定是柱進口處有異物時，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內即可。
[樣品濃度過高致使柱超載]
樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾（或伸舌）。
適當減小進樣量或樣品濃度（需要時，可提高檢測器靈敏度）直至峰形和保留時間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進樣量保持在3～50μg范圍內，不會引起明顯超載。
[樣品溶劑不對]
選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾，最好選用流動相溶解樣品。
[柱外效應]
柱外效應（即，進樣閥、色譜柱及檢測器間的管路過長、直徑過粗、管路接頭不匹配、有死體積）是影響色譜柱柱效的主要因素之一，所以，在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內徑盡可能細小，切口務必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴散造成不能反映色譜柱真實柱效等情況發生。
[緩沖不足或不合適]
在緩沖不好或離子強度過低的分離中，也會出現保留時間重現性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度（與樣品大小相匹配）能改善此情況。
[硅醇基團作用]
仔細分析色譜柱內填料表面性質可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團或金屬雜質之間相互作用而引起雙重保留機理，因此，發生了峰形拖尾。
為了減小峰形拖尾，通常可在流動相加入25mM三乙胺（抑制劑）。三乙胺能與硅醇基團發生強烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團的作用，以保證保留機理正常進行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但，持續力較三乙胺長。因為抑制劑分子中除了胺基與硅醇基團發生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會發生反相作用而產生保留現象。如果，將抑制劑加至樣品中，效果會顯著。
[柱內金屬污染]
柱內金屬污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進，也可由腐蝕性流動相緩慢溶解柱進口的金屬濾片，隨流動相沉積到柱填料中，例如，C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對稱的。
88.流動相與柱子如何才能做到匹配，達到最好的分離效果。目前我們實驗室有購買好的色譜柱，可是對樣品的分離效果不是很好。
答：不同填料的色譜柱都有自己的選擇性，相同填料不同廠家以及相同廠家不同品牌之間的選擇性都是不一樣的，一般情況下根據物質的性質將分離的大方向如：正相分析或者反相分析，確定后，一般可以根據調節色譜條件能得到好的色譜峰形，這方面的資料論壇當中很多，但是也有些色譜柱不管怎么調整色譜條件都不行，表面這款色譜柱的選擇性不適合該樣品的選擇。
89.我用的是C18柱，后面黑色的是我以前跑的圖，前面是我現在跑的圖形，完全一樣的東西，只是流動相不是一批配的（流動相的成分沒變），中間柱子別人用過了，峰型怎么發生了這么大的變化啊？可能的原因是什么啊？是不是柱子出了問題啊？
答：從兩個圖對比很明顯可以看出是柱效嚴重下降，且伴有肩峰。不同時間配的流動相，如果成分和pH沒變的話，肯定不會造成這個結果。估計是別人用柱子過程中，造成了柱頭塌陷、柱頭污染以及固定相流失等嚴重問題，如樣品太臟，流動相或樣品pH太高或太低，都會造成這個結果。
你可以試著用色譜柱清洗和再生的方法反沖維護一下，但不能保證一定能回到原來的效果。再生如果不行，考慮挖補柱頭填料，實在不行，柱子也只能報廢。建議柱子最好還是專門用于一種方法比較好，像你這種情況，都搞不清別人怎么用柱子的，分析解決問題就相當難。
90.柱子的柱效影響大嗎？一般柱子的柱效規定是多少的呀！理論塔板數一般要達到多少呢？主要有那些因素影響它。
答：柱效是柱子性能好壞的一個重要體現指標。柱效會影響分離度，當然是峰形越尖銳，柱效越高，和其它峰越容易分開。另外柱效高峰形尖銳，對峰面積的積分誤差就小，甚至可以用峰高來定量。
一般C18柱，在測定甲苯等不易拖尾的小分子中性不電離物質時，5μm的填料，每米的柱效能達到80000以上的塔板數，就算合格吧。在實際分析物的測定時，一般藥典有規定最低柱效是2000～3000，一般新柱子的柱效都高于這個數。但柱子在使用后，由于固定相流失等原因，柱效會逐步下降，當下降到不符合藥典最低柱效要求，或者導致分離度不夠時，色譜柱就算壽命到了。單從柱效逐步下降這個角度看，柱效高的色譜柱相對使用壽命更長。
影響柱效的因素有粒徑、粒徑和孔徑分布、固定相鍵合密度、柱外體積和溫度等，柱子裝填緊密、柱床均勻一致也對提高柱效有好處。這些影響因素中，很多是和生產廠商有關，你這邊能做的是盡量減少柱外連接體積。
91.流動相中加入四氫呋喃對柱子有損害嗎?我現在分析一樣品流動相中用到20%的四氫呋喃才能把峰分到基線.但柱子只能用一個星期分離效果就不好了.請問是四氫呋喃損壞了柱子嗎?
答：四氫呋喃（THF）是反相色譜中洗脫能力極強的溶劑，比甲醇和乙腈都強很多。在流動相中加入THF能改善某些難分離的物質對的分離度，但，THF不穩定，容易降解生成具有很強反應活性的過氧化物，能與分析物反應生成新化合物，導致拖尾、峰分裂和鬼峰產生。高反應活性的過氧化物還可以和填料固定相發生化學作用，THF對柱子有損傷這點是無疑的，而且這種損傷是隨時間累積的。THF保質期一般規定是6個月，放得越久，里面產生的過氧化物含量越大，你應該避免使用生產日期已很久的THF溶劑，而且最好將THF冷藏、干燥和避光保存，使用前最好能檢測一下過氧化物的含量。
92.在用液相色譜同時分離多種組分時，怎么通過條件色譜條件使各個峰達到比較理想的分離效果！
答：這是方法開發的大問題。方法開發建立，要做的就是：針對分析物和基體的情況不同，選擇色譜柱類型和分析條件，包括流動相溶劑類型、組成比例、pH值、溫度和流速等參數的確定。這方面的問題，要講起來內容非常多。
93.是樣品過載問題,按藥典檢測方法檢驗一些藥品有關物質時,都要注入高濃度的供試液,這樣往往使得柱過載而峰變形,按老師的方法減小濃度和注入量均是不允許的,怎么處理這問題?
答：藥典方法中注入高濃度供試液測定有關物質，提高注入濃度是為了把雜質峰的信號增強。有時候為了把雜質峰顯現出來，主峰因過載有所變形，如在允許范圍內，也能接受。但前提是雜質峰和樣品主峰分開，如果因過載而使兩峰沒有得到需要的分離度，雜質峰信號再強也失去了意義。我認為藥典規定的條件是允許在一定范圍內進行調節的，因為藥典沒有規定具體使用色譜柱的品牌，而不同品牌的柱子，上樣量是有差異的。對色譜條件微調，并取得到了很好的分析結果，如果規定不允許，那你首先要懷疑這個規定是否合理，或者是否對規定的理解有問題。
94.哪些原因會造成色譜峰變寬、峰高變低，有哪些解決辦法？
答：確實是這樣，如果其它色譜條件沒有改變，柱效下降是導致峰變寬的主要原因。對于易電離的極性物質，如果流動相pH選擇不合適，分析物既有中性分子態存在，又有離子態存在，峰也會變寬變矮。
色譜柱使用后柱效逐步下降是正常現象，如突然降低則屬異常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降則多半是使用不當，造成填料特性或柱床結構改變所致。如超過使用pH范圍造成的固定相和硅膠基體的流失、柱床塌陷等；還有強保留物質吸附在填料表面，形成非特異性吸附層，完全改變了原有固定相的表面活性和分離性能，使柱效下降；另外進樣時的壓力脈沖，也會破壞柱床結構影響柱效。
95.我以前做蘇丹紅用的是安捷倫的SB-C18柱，峰形什么都很好，最近發現4個標樣峰后都帶有一個小峰，一開始以為是標樣問題，后來換XDB-C18后標樣又正常了。可是用SB-C18柱做其他用正常，不知怎么回事？還有，像這種C18柱如果壓力過高能不能反沖，該如何沖洗？一般做獸殘、農殘什么的，而且感覺三聚氰胺做后壓力更易增高，且容易引發進樣器漏等問題，請問做完三聚氰胺需對系統做特殊清洗嗎？
答：用SB柱，標樣后帶一小峰，而且是只對蘇丹紅標樣測定時有，估計和蘇丹紅標樣的測定方法和其它樣品測定方法不同有關。最好能把譜圖貼上來看看，是什么樣的小峰？才能判斷是溶劑峰還是雜質峰。XDB柱和SB柱是有區別的，XDB鍵合度高，封尾良好，反相保留能力強；而SB柱，未進行封尾，對極性物質選擇性好。有可能你的蘇丹紅標樣分解了，有極性雜質生成，SB柱能把雜質分開，而XDB柱不能。
這兩款柱子壓力大了，可以反沖。有正常維護時的反沖沖洗和再生時的強溶劑沖洗兩種，沖洗方法在在線講座里也寫了，你再回到本貼的前面看看就可以了。
三聚氰胺和三乙胺類似，本身容易和硅醇基作用而吸附在填料表面，另外三聚氰胺測定的樣品基體含蛋白類的強保留物質較多，容易污染色譜柱柱頭引起填料間隙堵塞柱壓升高，最好每次做完樣后，都用甲醇或乙腈反向清洗維護一下。如有蛋白類的污染，也定時用本講座中提到的清洗方法做一下維護。
96.我是做農藥殘留分析的，不同的基質雜質含海量是不同的，我用C18分析時有可能一次就污染了，我用高流速，和反向沖洗都解決不了，是不是這根柱子就廢了，有沒有其他的辦法？
答：高流速反向沖洗是對的，關鍵你用了什么溶劑沖洗呢？用原來的流動相沖洗肯定不管用，要不然就不會累積在柱子上了。你應該用流動相中的強溶劑B沖洗，如果不行，就需要啟用再生的程序，當然再生時用的溶劑更強。
100％甲醇——100％乙晴——75％乙晴/25％異丙醇——100％異丙醇——100％二氯甲烷——100％正己烷。
用每種溶劑沖洗至少10個柱體積，對于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2mL/min。最后，用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動相體系。
再生還不解決問題，最后一招就是挖補柱頭填料，把柱頭污染的填料挖掉，用干凈填料填補進去。挖補填料，破壞原有柱床結構，挖補后柱效也不可能有新柱水平，或許能再維持一段時間，但不會長久。
97.還有溶劑中的金屬過濾頭生銹了，會有什么影響？會不會影響到柱子的壽命，金屬離子和柱子有沒有什么反應？
答：我覺得你就把銹當成顆粒物污染的一種，會導致拖尾、柱壓上升等。溶解的金屬離子一般在反相柱上沒有什么保留能力，馬上就會被沖出柱子，不會和固定相或者和硅膠基質反應。
98.如果在溶劑過濾時把水膜當成有機膜了溶解了而且這樣的溶劑又做有機相用了，造成C18柱壓由1000升到3000，流動相是乙腈和水，問一下這樣的柱子還能用么？有沒有什么補救方法？
答：溶解的膜作為了顆粒物堵塞篩板，引起柱壓上升，也只有反沖一下，如果能把堵在篩板上的膜殘渣沖走，柱壓下降了就OK了；如果，殘渣進入了柱子內部的填料間隙，會難沖一點，也只能多沖一會吧，實在不行，你又舍不得把色譜柱報廢，就只有挖補柱頭填料和換篩板了。
99.保護柱和預柱的作用是不是一樣的，如果不一樣有什么區別么？保留時間漂移多少為可以接受的范圍？
答：保護柱一般帶填料，相當于一根縮短了的色譜柱（一般是1～2cm長度），卡套里可更換的柱芯，柱管、篩板和填料都有。保護柱里的柱芯好像是在前面開路的掃雷部隊，流動相和樣品里如有什么損害柱子的污染物，保護柱就自己承受了下來。
而預柱，現在一般指的就是接在進樣器和色譜柱之前的在線過濾器。在線過濾器和保護柱的最大區別是不帶填料，只有可更換的篩板。預柱只能保護色譜柱免受顆粒物質的污染，而不能阻擋溶解在流動相中的強保留物質。
保留時間是液相色譜中一個很有用的診斷分離問題的工具。保留時間受流動相組成、溫度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影響，如果所有這些參數保持不變，保留時間也保持恒定。但在實際操作中，不可能對每個色譜參數進行很完美的控制，如即便加了柱溫箱，溫度還是會有波動；流動相組成會因組分揮發性不同而改變。
所以，保留時間有上下0.02～0.05min的變動是非常正常的，對某些方法有0.1min上下變動也屬正常。保留時間有大的變化，預示著系統和方法存在問題。流路里有氣泡存在，泵閥有泄漏，會因流量降低而導致保留時間增加。梯度混合比例閥故障也是保留時間變化原因之一。
100.液相色譜柱與氣相的柱子有何區別呢？
