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蛋白質被認為是構成生物體細胞組織的重要成分。食物中的蛋白質是人體中氮的唯一來源，具有糖類和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白質區別于其他有機化合物的重要標志。
牛乳中的蛋白質含量為3%～3.7%，是主要的含氮物質，其中主要為酪蛋白和乳清蛋白，還有少量的脂肪球膜蛋白。乳蛋白就整體而言，富含必需氨基酸且配比適宜，比自然界中任何其他天然食物都多，但酪蛋白中蛋氨酸的含量卻較少。
在檢驗食品中蛋白質時，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質換算系數，以此得到蛋白質含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標準檢驗方法。凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。
一凱氏定氮法的原理及步驟
蛋白質是含氮的有機化合物。樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨，與硫酸結合生成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數（乳及乳制品換算系數為6.38），即為蛋白質的含量。
（1）消化
濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性，可將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原為二氧化硫。二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。
蛋白質+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
消化時加入的硫酸銅是作催化劑，以加速分解反應，還可以加入氧化汞、氧化銅等作催化劑，為防止汞的污染，通常用硫酸銅較多。如果以汞或汞化合物作催化劑，則消化和加堿后，形成汞氨化合物。此化合物在蒸餾時不能完全分解，在這種情況下，必須加入鋅粉或硫代硫酸鈉或硫化鈉，使汞氨化合物分解。
C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2
有機物消化完后，溶液具有清澈的硫酸銅的藍綠色，同時硫酸銅在下一步蒸餾時可作堿性反應的指示劑。
在消化過程中添加硫酸鉀，與硫酸反應生成硫酸氫鉀，是為了提高溶液沸點，從而提高反應溫度，加速反應過程。此外，也可以加硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點。
在消化過程中，隨著硫酸的不斷分解、水分的不斷蒸發，硫酸鉀的濃度逐漸增大，沸點升高，加速了對有機物的分解作用。
加入過氧化氫，是利用其氧化性，以加快反應速度：
2H2O2→O2+2H2O
（2）蒸餾
在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，通過加熱蒸餾，氨隨水蒸氣蒸出：
(NH4)2SO4+2NaOH →2NH3+Na2SO4+2H2O
（3）吸收
加熱蒸餾時放出的氨可用硼酸溶液進行吸收。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。
2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O
（4）滴定 待吸收完全后，用硫酸或鹽酸標準溶液滴定生成的硼酸銨，屬于鹽類的滴定。硼酸為極弱的酸，在滴定中并不影響所用指示劑的變色反應。
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O→(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3
（5）計算 根據硫酸或鹽酸溶液消耗的體積，計算總氮含量，再乘以蛋白質系數（乳及乳制品換算系數為6.38），即為粗蛋白的含量。
二注意事項
（1）加入樣品及試劑時，避免黏附在瓶頸上。
（2）加入硫酸鉀的作用：提高硫酸的沸點（338℃），增進反應速度。但過多的硫酸鉀會造成沸點太高。生成的硫酸銨在513℃會分解，故此加入硫酸鉀的量一定要準確。
（3）加入硫酸銅的作用：催化劑，使氧化作用加速。
（4）消化時，采用長頸圓底凱氏燒瓶斜支于電爐上，其操作必須在通風櫥中進行，并使全部樣品浸泡在消化液中，防止樣品黏附在瓶頸上部，以致消化不完全；在消化過程中，樣品炭化變黑，產生泡沫，這時要減小火力。勿使黑色物質上升到凱氏燒瓶頸部，待消化液均勻沸騰后，再加大火力，直至消化液黑褐色消失呈淡藍色透明為止。如樣品含脂肪較多時，應適當增加硫酸量，用硫酸量少時，過多的硫酸鉀會形成硫酸氫鉀而不與氨作用，導致氨損失。
（5）當樣品消化液渾濁或未澄清透明時，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫后，再加入30%的過氧化氫，然后繼續加熱消化；
（6）蒸餾裝置要安裝平穩、牢固、嚴密，各連接部分不能漏氣。水蒸氣發生器裝水不可太滿，加玻璃珠以防爆沸。
（7）蒸餾時，蒸汽要發生均勻、充足，不得停火斷汽，否則蒸餾瓶內壓力降低會發生倒吸；避免瓶中的液體發泡沖出進入接收瓶。加堿量要足，動作要快，防止氨損失。冷凝管出口一定要浸入吸收液中，防止氨揮發損失。要保證蒸餾裝置不能漏氣
（8）蒸餾結束后，應先將吸收液離開冷凝管口，以免發生倒吸。判斷是否蒸餾完全，可用pH試紙測試冷凝管口的冷凝液而確定。
（9）在蒸餾時反應室與外界存在的壓力差，蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時，要保證蒸汽均勻、充足，中間不能停止加熱，防止發生倒吸；
三常見問題解答
一、消化過程中容易沾壁怎么辦？消化后定氮瓶內有黑色殘留物怎么辦？
解答：稱樣時需要注意切勿使樣品粘附在定氮瓶頸部，避免因樣品未消化完全而造成結果偏低。消化過程中如果發生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色殘留物，可以在消化較完全時搖動定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物質搖洗下來。搖動的方法是取下小漏斗，戴上防燙手套，手掌緊握瓶頸，向前后側甩，使瓶內液體呈半旋轉半振蕩狀態，注意控制力度不要讓液體濺離瓶口。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？
解答：硫酸鉀的作用是提高溶液沸點，從而加快有機物分解。但是不能加入過多的硫酸鉀，否則會因為溫度過高，使生成的硫酸銨發生熱分解成氨而造成損失。
三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑？
解答：硫酸銅的作用有三個，分別為：
①催化作用：加速有機物的氧化分解。
②消化完全的指示劑：使液體呈現藍綠色澄清透明狀態。
③蒸餾時堿性反應的指示劑：產生褐色沉淀。
四、混合指示劑必須臨用時混合嗎？
解答：混合指示劑必須臨用時混合。
五、蒸餾的時取下錐形瓶需要用洗瓶沖洗嗎？不沖洗會有誤差嗎？
解答：需要沖洗冷凝管下端以防止產生結果誤差。蒸餾后移動蒸餾液接收瓶,液面離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部,然后取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？
解答：可以將蒸餾裝置連接好后，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開電爐加熱，觀察有無氣泡產生。
七、硼酸可以多加嗎？
解答：不可以。按國標的要求正確操作，10mL硼酸足夠。
八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？
解答：不能更改國標給出的滴定液濃度。蛋白質含量較高的樣品可以適當減少稱樣量，或合理范圍內減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標準滴定液的體積指的是什么？
解答：試劑空白實驗消耗的標準滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時有兩種蛋白怎么換算？
解答：同時含有多種蛋白質，且折算系數不相同時可以按復合配方食品換算蛋白質系數。
凱氏定氮儀使用常見問題解答
1、 凱氏定氮儀在蒸餾時翻滾劇烈，會對操作者構成危險嗎？
答：一般不會，凱氏定氮儀在蒸餾時翻滾劇烈，是水蒸氣大量進入消化管液體翻滾，并非劇烈反應造成；而且儀器有超壓保護裝置，可以保持管路內部常壓，避免危險。
2、 凱氏定氮儀工作中對水質有什么要求？
答：凱氏定氮儀的蒸餾水桶內要裝蒸餾水或純水，機器長期不用要將蒸餾器里水放掉。
3、 凱氏定氮儀開機沒聲音是怎么回事？
答：凱氏定氮儀開機沒聲音，如果機器電源開關內紅燈亮，說明是定氮儀內保險管燒斷了，保險管位置在機器內部靠近電源開關接口5公分處黑色殼子內。
4、 凱氏定氮儀開機后蒸餾器內不加水怎么解決？
答：開機半分鐘后檢查蒸餾水桶是否漏氣，能被氣充鼓是正常；檢查蒸餾水桶內水位是否超過三分之一，不夠補齊；檢查蒸餾水桶的位置，低于放置儀器的臺面，壓力不夠，加不上水；檢查蒸餾水桶進氣、進液管是否接錯，接錯桶內會產生氣泡并發出聲響；檢查排水閥，應呈關閉狀態。
5、 凱氏定氮儀蒸鍋不加熱，不能產生蒸氣，為什么？
答：如果機器能正常加堿，不能加熱出蒸氣，判定加熱絲可能燒壞了，可拿萬用表量一下加熱絲正負極，不通可確定加熱絲損壞，換新加熱絲。
如果機器不能正常加堿，開機后又沒有任何聲音，判斷是保險絲燒斷了，保險管位置在機器內部靠近電源開關接口5公分處黑色殼子內。
6、 凱氏定氮儀工作時聲音大，是否正常？
答：屬于正常現象，這是機器內部氣泵工作的聲音。
7、 凱氏定氮儀工作中不能加堿、加堿沒有聲音，為什么？
答：檢查堿桶是否漏氣，被氣充鼓機器才能正常工作；儀器使用時間過長，堿管內部會產生結晶，導致加液時流速降低，沒有聲音。
8、 定氮儀在工作時，從頂部冒出類似煙的氣體，怎么回事？
答：檢查冷卻水進水的水龍頭是否打開，冷卻水關閉或者水量小都會導致消化管出來的蒸氣不能被冷凝，從機器里冒出來的水蒸氣，看起來類似煙。
9、 定氮儀使用中發現消化管進滿水，怎么解決？
答：定氮儀使用中發生消化管進滿水，是由于機器控制水位器導電性降低造成的，解決辦法：打開水位器取出探針用砂紙打磨，去掉氧化層；在蒸餾水桶里加入3-5克實驗室用氯化鈉，搖勻溶解。
10、定氮儀使用中發生蒸餾器、水位器進滿水，硼酸吸收液容器中進水，怎么解決？
答：是機器控制水位器導電性降低造成的，解決辦法：打開水位器取出探針用砂紙打磨，去掉氧化層；在蒸餾水桶里加入3-5克實驗室用氯化鈉，搖勻溶解。
11、定氮儀使用中消化管中白色管子發生倒吸，怎樣解決？
答: 儀器停止工作（蒸餾器停止加熱），氣閥未能及時關閉，會產生倒吸現象，可在白色管子上扎一些小孔。氣閥損壞，不能關閉，也會倒吸。
12、定氮儀工作中隔3-5秒鐘會發出聲響，是否正常？
答：這種聲響屬于正常現象，儀器工作狀態下，蒸餾器會不斷加熱產生水蒸汽而消耗水，儀器會自動打開水閥進行補水，聲響就是水閥打開、關閉的聲音，屬于正常現象。
注：
1、每次使用儀器前，應讓儀器空煮一次，清洗儀器的內部管路。
2、儀器使用完畢，應將其中一只桶的桶蓋打開，將桶內的氣體排出，延長附件的使用壽命（3個或2個桶串聯，排氣時只打開一只桶蓋即可）。
