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誘變育種是利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群,促進其突變率大幅度提高,然后采用簡便、快速和高效的篩選方法,從中挑選少數符合育種目的的突變株,以供生產實踐或科學研究用. 當前發酵工業和其他生產單位所使用的高產菌株,幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產性能的菌株.誘變育種除能提高產量外,還可達到改善產品質量、擴大品種和簡化生產工藝等目的.誘變育種具有方法簡單、快速和收效顯著等特點,故仍是目前被廣泛使用的主要育種方法之一.
一、實驗目的和內容:
目的:
以紫外線誘變獲得用于醬油生產的高產蛋白酶菌株為例,學習微生物誘變育種的基本操作方法.
內容:
1．對米曲霉(Aspergills oryzae )出發菌株進行處理,制備孢子懸液.
2．用紫外線進行誘變處理.
3．用平板透明圈法進行兩次初篩.
4．用搖瓶法進行復篩及酶活性測定.
二、實驗材料和用具:
米曲霉斜面菌種；
豆餅斜面培養基、酪素培養基、蒸餾水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、試管、培養皿(9cm)、恒溫搖床、恒溫培養箱、紫外照射箱、磁力攪拌器、脫脂棉、無菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精燈.
三、操作步驟:
(一)出發菌株的選擇及菌懸液制備:
1、出發菌株的選擇:
可直接選用生產醬油的米曲霉菌株,或選用高產蛋白酶的米曲霉菌株.
2、菌懸液制備:
取出發菌株轉接至豆餅斜面培養基中,30℃培養3～5d 活化.然后孢子洗至裝有1mL 0.lmol/L pH6.0 的無菌磷酸緩沖液的三角瓶中(內裝玻璃珠,裝量以大致鋪滿瓶底為宜),30℃振蕩30min,用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過濾,制成把子懸液,調其濃度為106～108 個/mL,冷凍保藏備用.
(二)誘變處理:
用物理方法或化學方法,所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定,有時還可采用復合處理,可獲得更好的結果.本實驗學習用紫外線照射的誘變方法.
1、紫外線處理:
打開紫外燈(30W)預熱20min.取5mL 菌懸液放在無菌的培養皿(9cm)中,同時制作5 份.逐一操作,將培養皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上,照射l min 后打開培養皿蓋,開始照射,與照射處理開始的同時打開磁力攪拌器進行攪拌,即時計算時間,照射時間分別為15 s、30 s、l min、2 min、5 min.照射后,誘變菌液在黑暗冷凍中保存1～2h 然后在紅燈下稀釋涂菌進行初篩.
2、稀釋菌懸液:
按10 倍稀釋至10-6,從10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培養基平板中(每個稀釋度均做3 個重復),然后涂菌并靜置,待菌液滲入培養基后倒置,于30℃恒溫培養2～3d.
(三)優良菌株的篩選:
1、初篩:
首先觀察在菌落周圍出現的透明圈大小,并測量其菌落直徑與透明圈直徑之比,選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落40～50 個,作為復篩菌株.
2、平板復篩:
分別倒酪素培養基平板,在每個平皿的背面用紅筆劃線分區,從圓心劃線至周邊分成8 等份,1～7 份中點種初篩菌株,第8 份點種原始菌株,作為對照.培養48h 后即可見生長,若出現明顯的透明圈,即可按初篩方法檢測,獲得數株二次優良菌株,進大搖瓶復篩階段.
3、搖瓶復篩:
將初篩出的菌株,接入米曲霉復篩培養基中進行培養,其方法是,稱取麥秩85g,豆餅粉(或面粉)15g,加水95～110mL(稱為潤水),水含量以手捏后指縫有水而不下滴為宜,于500mL 三角瓶中裝入15～20g(料厚為1～1.5cm),121℃濕熱滅菌30min,然后分別接入以上初篩獲得的優良菌株,30℃培養,24h 后搖瓶一次并均勻鋪開,再培養24～48h,共培養3～5d 后檢測蛋白酶活性.
4、蛋白酶的測定方法:
(1)取樣:培養后隨機稱取以上搖瓶培養物1g,加蒸餾水100mL,(或200mL),40℃水浴,浸酶1h,取上清浸液測定酶活性.另取lg 培養物于105℃烘干測定含水量.
(2)酶活性測定:30℃ pH7.5 條件下水解酪蛋白(底物為0.5%酪蛋白),每分鐘產酪氨酸1μg 為一個酶活力單位.計算公式為:
(A 樣品OD680nm 值-A 對照OD680nm 值)×K×V/t×N
K:標準曲線中光吸收為“1”時的酪氨酸微克數；
V:酶促反應的總體積；
t: 酶促反應時間(min)；
N:酶的稀釋倍數.
5:谷氨酸的檢測:
此項檢測也是醬油優良菌株的重要指標之一.
檢測培養基:豆餅粉:麩夫=6:4,潤水75%,121℃濕熱滅菌30min.
谷氨酸測定:于以上培養基中加入7%鹽水(W/V),40～45℃水浴,水解9d 后過濾,以濾液檢測谷氨酸含量(測壓法).
四、注意事項:
1、紫外線照射時注意保護眼睛和皮膚.
2、誘變過程及誘變后的稀釋操作均在紅燈下進行,并在黑暗中培養.
五、實驗報告:
1、試列表說明高產蛋白酶菌株的篩選過程和結果.
2、你認為以上的篩選方法有什么優缺點,如何改進？
六、問題和思考:
1、試述紫外線誘變的作用機理及其在具體操作中應注意的問題.
2、為什么在誘變前要把菌懸液打散和培養一段時間？
注:篩選菌株數的計算 若按突變率為0.01 計算,則一次篩選可取250—300 個菌落,
第一次篩選后可多選幾株高產株,而二級篩選為重點階段,其最適量可參考以下計算方法:如初篩菌株數為200 株,二次篩選欲選株數為2 株,則二級應選(200×2)1/2,為20 株,這樣的數量選擇,使有可能從較少的數量中獲得相對較多的優良菌株.
