蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介,感染主要取決于沙門氏菌的血清型和食用者的身體狀況,受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個(gè)體.根據(jù)國(guó)際慣例,要求對(duì)易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理,以使大多數(shù)食物不含沙門氏菌,從而有效預(yù)防沙門氏菌病.為此,人們?cè)谔剿魃抽T氏菌檢測(cè)方法的過程中,作出了不懈的努力,現(xiàn)將有關(guān)進(jìn)展報(bào)告如下,并介紹兩種快速檢測(cè)沙門氏菌的試劑盒.

    自19世紀(jì)后期,沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來,檢測(cè)方法學(xué)都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎(chǔ)上.此后的60年間,用于從食品中分離沙門氏菌的方法實(shí)質(zhì)上與那些用于臨床病料的方法是相同的.但至少有三個(gè)因素限制了用于臨床病料的方法應(yīng)用在食品分析上.第一,通常,沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二,食品本身的性質(zhì)會(huì)干擾病原的檢測(cè),例如,某些食品中固有菌群可能處在一個(gè)很高的水平,從而影響特定細(xì)菌的選擇性分離和鑒定；第三,與臨床病料不同的是,經(jīng)過加工的食品,由于加熱、干燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用,其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱“致傷”.這就形成了一個(gè)具有不同生長(zhǎng)特性的細(xì)菌群.這種現(xiàn)象對(duì)那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響,因?yàn)樵谶x擇培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)“致傷”的沙門氏菌通常是以細(xì)菌死亡和試驗(yàn)失敗而告終.為克服這些困難,人們建立了一種簡(jiǎn)單的微生物增殖步驟,專門針對(duì)以食品為傳播載體的病原.雖然這些方法本身證明是可靠的,但卻很費(fèi)力、耗時(shí),需要4～7天才能完成.因此,在需要及時(shí)、快速評(píng)價(jià)食品中微生物的安全性時(shí),通常不被采用.隨著DNA和抗體技術(shù)的發(fā)展,近10～15年間發(fā)展了無數(shù)改進(jìn)的方法,其中許多可以在48h內(nèi)檢出沙門氏菌,這些方法通稱為快速檢測(cè).

 

1、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法

    用于沙門氏菌分析的傳統(tǒng)方法是食物樣品分步增菌,以增加病原的可檢出率,這種培養(yǎng)方法總體可分4個(gè)不同階段或步驟.第一步(預(yù)增菌),將樣品加到一種高營(yíng)養(yǎng)、無選擇性的培養(yǎng)基中,溫度37℃,使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長(zhǎng).雖然緩沖胨水被建議常規(guī)使用(由于其可保持溶液pH值穩(wěn)定),但對(duì)培養(yǎng)基的選擇仍存有爭(zhēng)論.第二,是選擇性增菌步驟,它使沙門氏菌生長(zhǎng)而使肉湯中同時(shí)存在的微生物數(shù)量減少,與預(yù)增菌培養(yǎng)基相似,對(duì)選擇性培養(yǎng)基的選擇,也存在許多不同的觀點(diǎn).目前應(yīng)用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionate broth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenite cystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養(yǎng)基.由于沒有任何一種培養(yǎng)基可以全面地保持所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型,所以,較適當(dāng)?shù)淖龇ň褪鞘褂脙煞N培養(yǎng)基平行地進(jìn)行試驗(yàn).第三步是分離步驟,即選擇性培養(yǎng)物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長(zhǎng)制劑的瓊脂平板上劃線培養(yǎng),然后對(duì)平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn),并對(duì)該菌落分離物進(jìn)行一系列生化和血清學(xué)檢測(cè),以作出鑒定.傳統(tǒng)沙門氏菌檢測(cè)法全過程需時(shí)至少4～7天,才能得出明確的診斷結(jié)果.

2、以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

    利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性,來進(jìn)行細(xì)菌的鑒別和血清學(xué)定型,已有半個(gè)多世紀(jì)的歷史.細(xì)菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在,使得人們可以建立一些快速方法來檢測(cè)以食品為載體的病原.已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法有許多種,大致可分為以酶標(biāo)抗體(ELISA),熒光抗體染色(免疫熒光法),同位素標(biāo)記抗體(放射免疫試驗(yàn))為基礎(chǔ)的方法及其它多種以抗體為基礎(chǔ),利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散及免疫色譜技術(shù)的方法.但常規(guī)中最廣泛采用的是以雙位點(diǎn)ELISA技術(shù)即夾心ELISA為基礎(chǔ)的方法.此法改進(jìn)后用有放射活性的同位素替代標(biāo)記抗體,概括地說,是指以固定在固體基質(zhì)上的“捕捉”抗體來捕捉目標(biāo)抗原,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的成分,加入第二種酶標(biāo)抗體,此者結(jié)合在捕捉到的抗原的不同位點(diǎn)上,第二次洗滌后加入酶作用基質(zhì),并令其與顏色成分反應(yīng),然后用分光光度法即很容易檢測(cè)到目標(biāo)抗原.采用微量滴定板作為固態(tài)基質(zhì)使反應(yīng)形式標(biāo)準(zhǔn)化,并促成其自動(dòng)化.

    最近黎兆滾等人首次在國(guó)內(nèi)口岸系統(tǒng)應(yīng)用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物產(chǎn)品(魚粉、肉骨粉等)進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè).該法采用預(yù)先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板,加入經(jīng)增菌處理的樣品,反應(yīng)后再加入一定的指示劑,作用畢后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值來判定結(jié)果.食物樣品經(jīng)適當(dāng)?shù)脑鼍�處�?也可用此法進(jìn)行沙門氏菌檢測(cè).

    ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106個(gè)細(xì)胞/ml,因此,要得出可靠的結(jié)果,食物樣品首先必需進(jìn)行預(yù)增菌、選擇性增菌,通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進(jìn)行后增菌,以促進(jìn)鞭毛發(fā)育.總的來說,標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品的制備,約需要經(jīng)過40～48h的孵育才能完成.黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)樣品制備過程分三步,共耗時(shí)24h：①選用營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行預(yù)增菌(6h),使“致傷”、冷凍的沙門氏菌復(fù)蘇.②使用選擇性培養(yǎng)基RV進(jìn)行增菌(14h),使沙門氏菌大量繁殖,同時(shí)抑制其它雜菌生長(zhǎng).③使用營(yíng)養(yǎng)肉湯(蛋白胨水)進(jìn)行后增菌(4h),使沙門氏菌的數(shù)量大大增加.比上述標(biāo)準(zhǔn)的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時(shí)間.ELISA方法本身,則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時(shí)間,90min是孵育時(shí)間).相比之下,黎兆滾等人的方法可在27h內(nèi)完成,比上述方法縮短了一半的時(shí)間,頗值得推廣應(yīng)用.

    最新式的沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)法,利用經(jīng)特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎(chǔ).幾滴樣品加到卡片上,結(jié)果可以直接用肉眼讀出.免疫色譜卡片極易操作,且由于無需要特殊設(shè)備,很適合小型實(shí)驗(yàn)室使用.盡管卡片檢測(cè)法與ELISA法一樣需要對(duì)樣品進(jìn)行增菌處理,但它(卡片法)本身通常需時(shí)不超過10min,如果采用黎兆滾等人的樣品制備法,則可使操作時(shí)間更為縮短.

 

3、以核酸為基礎(chǔ)的方法

    細(xì)胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子.由于所有的細(xì)胞都含有這種分子,可以利用它作為檢測(cè)的標(biāo)靶.標(biāo)靶通常是一個(gè)特異性核酸序列,它可通過以補(bǔ)體核酸分子作為探針來檢出.與免疫學(xué)方法相似,探針也需要加附適當(dāng)?shù)臉?biāo)記,如放射性同位素、酶或發(fā)光的標(biāo)識(shí)物.Fitts等人在食品沙門氏菌檢測(cè)中引入了第一代DAN—RNA雜交技術(shù),此法應(yīng)用的探針含有用放射性同位素標(biāo)記的傷寒沙門氏菌DNA片段,其敏感性高,經(jīng)大約48h的增菌步驟后,檢測(cè)極限可達(dá)108個(gè)細(xì)菌/ml,但由于要使用放射性同位素,只能在專門的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用,此方法的優(yōu)點(diǎn)都被抵消了.為此,以核酸雜交為基礎(chǔ)的第二代技術(shù)—比色計(jì)目前已發(fā)展起來.這種方法依賴于沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發(fā)育過程中儲(chǔ)存的核酸成分的檢測(cè).核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成器的一部分,每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中存在5000～20 000個(gè)復(fù)制體,而相比之下染色體DNA復(fù)制體僅2～10個(gè).這種天然富含rRNA標(biāo)靶序列的情況使得用無輻射計(jì)檢測(cè)成為可能,同時(shí)又保持了與放射性同位素方法相當(dāng)或更高的敏感性.其另一優(yōu)點(diǎn)是由于rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈),雜交前無需經(jīng)過變性步驟.要得到陽性結(jié)果,此法需要105個(gè)靶細(xì)胞/ml,因此對(duì)沙門氏菌檢測(cè)來說,需要進(jìn)行預(yù)增菌和選擇性增菌,總共約50h.rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法更耗時(shí),但二者成本相近.

 食品細(xì)菌檢測(cè)法的最新進(jìn)展是在化學(xué)擴(kuò)增體系方面的發(fā)展,即聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),用該體系可對(duì)制備好的樣品進(jìn)行細(xì)菌DNA擴(kuò)增,以便更易于用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測(cè).用于檢測(cè)沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業(yè)已建立,其中一些方法顯示了極好的敏感性.但該法較難自動(dòng)化,且必需經(jīng)選擇性增菌以稀釋可能干擾檢測(cè)反應(yīng)的某些成分.一個(gè)完整的以PCR為基礎(chǔ)的方法,需要2天才能完成,很大程度上抵銷了其高敏感性的優(yōu)點(diǎn),但這種方法對(duì)那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌“致傷”嚴(yán)重難以復(fù)蘇而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效.

    盡管目前用來檢測(cè)沙門氏菌的方法各有優(yōu)缺點(diǎn),但隨著科學(xué)發(fā)展,技術(shù)進(jìn)步,人們探索、實(shí)踐的繼續(xù)深入,我們可以期待,將會(huì)有更多,敏感性更高,特異性更強(qiáng),診斷時(shí)間更短的新方法出現(xiàn).

 

4、兩種沙門氏菌快速檢測(cè)法

4.1　Transia沙門氏菌平板檢測(cè)法

    與耗時(shí)、昂貴的傳統(tǒng)方法相比,此法快1～2天,且每次檢測(cè)所需的操作時(shí)間縮短.該法建立在夾心ELISA法的基礎(chǔ)上,利用多抗體混合物以保證檢出所有的沙門氏菌血清型.反應(yīng)的固相載體是一種有可見或不可見條紋的微量反應(yīng)板.其小孔內(nèi)包被有沙門氏菌的特異性單克隆抗體.

    第一階段,在小孔內(nèi)加入樣品和抗體聯(lián)合物(沙門氏菌屬特異性單克隆和多克隆抗體的混合物).孵育期間,沙門氏菌抗原和包被抗體形成了一種復(fù)合物：包被單克隆抗體-沙門氏菌抗原-抗體聯(lián)合物.洗滌后,通過每孔加入基質(zhì)溶液(過氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)來顯示上述復(fù)合物;酶催化色素原的氧化,結(jié)果產(chǎn)生藍(lán)色.加入反應(yīng)終止液終止催化反應(yīng),并使反應(yīng)混合物酸化,顏色由藍(lán)變黃.

    這種ELISA方法可對(duì)經(jīng)選擇性增菌及熱休克作用后,釋放了特異性沙門氏菌抗原的食品和環(huán)境樣品進(jìn)行檢測(cè).如采用黎兆滾等人的樣品制備法,可大大縮短檢測(cè)時(shí)間；此法可在沒有酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,從這點(diǎn)來說,Transia沙門氏菌平板檢測(cè)法比黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更適應(yīng)于一般的實(shí)驗(yàn)室使用.

4.2　Transia沙門氏菌卡片檢測(cè)法

    此法以單步免疫反應(yīng)即夾心型免疫色譜反應(yīng)為基礎(chǔ).反應(yīng)固相包括一塊用“抗沙門氏菌抗體-染料”偶合物浸透的染料襯墊和一張薄膜條,抗沙門氏菌抗體就固定在薄膜的反應(yīng)區(qū)上.增菌后,增菌肉湯用移液管加到樣品小孔內(nèi)并令其吸收,如樣品存在沙門氏菌抗原,它們會(huì)與偶合物作用,然后依次遷移到膜上,與固定在膜上反應(yīng)區(qū)的抗體結(jié)合,在反應(yīng)窗上呈現(xiàn)一條色帶.最后結(jié)果可在5～7min內(nèi)讀取.此法也適用于沒有酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)室.如采用黎兆滾等人的樣品制備法,可更加縮短檢測(cè)時(shí)間,可在普通實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行.