實驗原理:細胞中的DNA受1NHC1,60℃水解作用以后,核酸中的嘌呤堿很快完全被除掉,使脫氧核糖中潛在的醛基獲得自由狀態(tài)。水解后,組織要經(jīng)水洗再移至希夫(Schiff)試劑 中,希夫試劑 即同露出來的醛基發(fā)生反應(yīng),呈現(xiàn)紫紅色。這個反應(yīng)是Feulgen在1942年提出來的,是DNA的一個特異性檢查法。
水解的時間很重要,因為核酸的水解有兩個過程,第一,漂呤堿很快被除掉,脫氧核糖中潛在的醛基顯露出來,第二,組蛋白和核酸愈來愈多地被除掉。在短時間的水解作用以后,第一個過程占優(yōu)勢,這時候用希夫試劑染色,染色體的染色作用最強。隨著水解作用的繼續(xù)進行,第二個過程逐漸變成優(yōu)勢,因此水解液中的希夫反應(yīng)增強,而染色體中的希夫應(yīng)減弱。最后,第二個過程超過第一過程時,染色體也隨之停止反應(yīng)。
希夫試劑是堿性品紅———亞硫酸溶液,呈無色。與DNA醛基反應(yīng)后,使堿性品紅恢復(fù)原來的紅色。
二、實驗?zāi)康模河^察蠶豆根尖細胞或其它根尖細胞內(nèi)染色體中的DNA,以及染色體在有絲分裂中的行為,掌握Feulgen染色方法。
三、實驗材料:上次實驗制成了石蠟切片。
四、實驗準備:
1.用具 立式染色缸一套,鑷子,蓋玻片,小漏斗,鐵架,毛邊紙,玻璃棒,顯微鏡,恒溫水浴 鍋,溫度計,燒杯,棕色瓶,黑紙。
2.玻璃器皿的清洗 主要是染色缸的清洗,一般用肥皂粉洗,用水沖凈即可,如不能洗凈時,要用洗液浸泡后,再沖洗,自來水洗后,再用少量蒸餾水過洗一次。盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必須干燥,缸蓋內(nèi)緣必須涂以幾士林,以防止蒸發(fā)和收水分,影響濃度。染色缸上要貼上標簽。
3.實驗所需藥口及配制
濃鹽酸(36—38%),堿性品紅,偏重亞硫酸鈉(Na2 S2 O5 );
亞硫酸鈉(Na2 SO3 ),固綠(fast green),加拿大中性樹膠乙醇(30—100%),二甲苯。
藥品配制:
1各種濃度的乙醇配制.
21NHCI配制:取濃HCI 82.5毫升加蒸餾水至1000毫升,搖勻。
3Sciff 試劑的配制
0.5克堿性品紅,加到已經(jīng)煮沸的100毫升蒸餾水中,再煮沸3—4分鐘,待溶液冷卻到50℃時過濾,再等溶液冷到25℃以下時,加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亞硫酸鈉,裝在棕色瓶中,塞緊瓶子,用黑紙包好,放在暗處,第二天觀察,溶液還是淡紅色就不能用,只得重配。
偏重亞硫酸鈉與1NHCI反應(yīng),放出SO2 ,SO2 與堿性品紅反應(yīng),生成堿性品紅--亞硫酸溶液,呈無色。
4漂染液的配制
先配10%的亞硫酸鈉溶液。
把10%亞硫酸鈉溶液10毫升加200毫升蒸餾水,再加10毫升1NHCI,即成漂當液。
5固綠染色液
0.5克固綠溶于100毫升95%乙醇溶液。
五、實驗步驟:
2.水解 先在恒溫水浴 箱中準備好恒溫60℃的1NHCI。注意一定要控制好溫度不能過高,高了醛基要破壞,低了小解不充分,醛基不能釋放出來。水解的時間長短要根據(jù)材料,以及固定液的種類而定。根據(jù)試驗結(jié)果,取一個適當時間。
因加拿大樹膠溶于二甲苯,所以片子一定要經(jīng)二甲苯透明后才進行封片,操作方法如下:
1.用鑷子從二甲苯中取出載玻片,以毛邊紙吸干余液。
2.左手開啟樹膠瓶,右手用瓶中玻璃棒蘸取樹膠滴于載玻片上,并隨即蓋好瓶蓋。樹膠的用量視蓋玻片大小而定。要使樹膠在蓋玻片下滿布,不發(fā)生過多或不足。
3鑷取潔凈蓋玻片,以一邊澆于載玻片上,然后徐徐放下,使樹膠布滿蓋玻片與載玻片之間。產(chǎn)生氣泡的原因是覆蓋太快樹膠用量不足,或樹膠過稠。氣泡侵入后,妨礙鏡檢,且使標本褪色。如有氣泡產(chǎn)生,則可以在靠近氣泡的一邊再滴樹膠一滴,然后輕壓蓋玻片,使氣泡逸出。
片子封片后,放在切片木框上,讓其自然干燥,即可保存。