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植物組織總RNA的制備:異硫氰酸胍—酚法

放大字體  縮小字體 發布日期:2013-07-31  來源:實驗室資訊網
核心提示:異硫氰酸胍酚法提取RNA的原理如下:GIT與-巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性;GIT與 十二烷基肌氨酸鈉 (Sarcosyl)作用使蛋白質
 異硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下:GIT與β-巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性;GIT與 十二烷基肌氨酸鈉 (Sarcosyl)作用使蛋白質變性,從而釋放RNA;酸性條件下DNA極少發生解離,同蛋白質一起變性被離心下來,RNA則溶于上清中。該法所提RNA純度高完整性好較適合純化mRNA,逆轉錄及構建cDNA文庫,因此為大多數人采用。與氯化銫方法比較,雖然純度稍差一些,小分子RNA,如tRNA、snRNA不易去除,但產量高完整性好,鹽易去除。
一、材料、試劑和儀器
1 材料 植物組織(根或葉)
2 試劑
1) 異硫氰酸胍溶液:4mol/L 異硫氰酸胍(GIT),25mmol/L檸檬酸鈉(pH 7.0),0.5% 十二烷基肌氨酸鈉 (Sarcosyl), 0.1M β-巰基乙醇 (用時再加,0.36mL/50mL體系)
2) 2mol/L NaAc (pH4.0):用醋酸配,加少量水調pH。
3) 水飽和酚 (pH3.5)
4) 氯仿/異戊醇(CI)(24:1)
5) 異丙醇 ( -20℃存放)
6) DEPC-H2O (0.1%,V/V)
3 儀器 : 冰凍離心機,研缽
二、實驗程序
1 大量提取
1) 取植物組織5g加入液氮充分研磨,轉到一支預冷50mL的離心管 中,順序加入:15mL 異硫氰酸胍溶液,1.5mL 2M NaAc(pH4.0),15mL水飽和酚和3mL氯仿/異戊醇。混勻后置冰上15min。
2) 4℃,15 000g 離心30min轉上清于另一管中,加等體積異丙醇,混勻-20℃沉淀1hr.。
3) 4℃,15 000g 離心25min,棄去上清,加5mL 異硫氰酸胍溶液溶解沉淀后再加異丙醇—20℃沉 淀1hr。離心收集RNA沉淀,70%乙醇洗一次后晾干,加500μl DEPC處理的水溶RNA。取5μl電泳檢測完整性,取5μl測紫外吸收值檢測純度及濃度。
2 小量提取
1) 取2g左右植物組織放入研缽中,反復加入液氮充分研磨至粉末狀。加4-5mL異硫氰酸胍溶液。轉移到小離心管 中,每管0.5mL。
2) 置于冰上,順序加入:50μl 2mol/L NaAc , 混勻,0.5mL水飽和酚, 170μl CI,混勻。置冰上15min。
3) 各管平衡后,4℃,12 000g離心20-30min。轉移上清到另一管中,加入等體積的異丙醇,混勻,-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12 000g離心20min回收RNA。
4) 用70%乙醇洗一次,4℃,12 000g離心5min。吸去乙醇,空氣中吹干RNA沉淀。用150μl 異硫氰酸胍溶液,65℃吹打RNA沉淀溶解。
5) 加等體積異丙醇-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12 000g離心20min回收RNA。
6) 用70%乙醇洗兩次后,吹干溶于適量的DEPC-H2 O中。部分分裝后進行純度及完整性的檢測。其余加2.5倍體積乙醇沉淀于-80℃冰箱中存放。
7) 紫外分光光度分析純度和含量,甲醛變性瓊脂 糖凝膠電泳分析完整性。
編輯:songjiajie2010

 
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