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DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

放大字體  縮小字體 發布日期:2013-08-30  來源:實驗室資訊網
核心提示:堿裂解法原理在pH 12.0 ~ 12.6堿性環境中,細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開,而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞
 堿裂解法原理
在pH 12.0 ~ 12.6堿性環境中,細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開,而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下,大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀,而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心,可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質,質粒DNA尚在上清中,然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。
 
電泳檢測:質粒電泳一般有三條帶,分別為質粒的超螺旋、開環、線型三種構型
 
DNA提取過程中各種試劑的作用及原理
溶液I—溶菌液:
溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵,因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時,溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖:增加溶液的粘度,維持滲透壓,防止DNA受機械剪切力作用而降解。
EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子,抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基);(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。
2.溶液II-NaOH-SDS液:
NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是穩定的。
但當pH>12或pH<3時,就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。
在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L,加抽提液時,該系統的pH就高達12.6,因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。
SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:
(1)溶解細胞膜上的脂質與蛋白,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。
(2)解聚細胞中的核蛋白。
(3)SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質的復合物,使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去除干凈,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時)受到干擾。
編輯:songjiajie2010

 
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關鍵詞: DNA提取
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