手機(jī)版
原理：
Ø 酶譜法的基本過(guò)程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明膠）電泳分離，然后在有二價(jià)金屬離子存在的緩沖 系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在 藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
復(fù)性原理：在電泳過(guò)程中，SDS與樣品中的MMPs結(jié)合（當(dāng)然是可逆性結(jié)合），破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發(fā)揮其分解明膠的作用，而只有當(dāng)將膠置Trition中洗脫（最好是放在搖床上搖，30min／次，做2次或15min/次，4次。靜置于Trition中是不妥的。）時(shí)，由于SDS被Trition結(jié)合而去除，從而使MMPs恢復(fù)了活性。
試劑的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝膠（含1.0mg/ml 明膠，配好后1周內(nèi)使用，明膠含量低靈敏度高）
A．分離膠的配制（注：根據(jù)你所用的電泳儀膠的大小確定配制膠的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝膠 10ml（包括）
ddH2O 4.5ml
30%儲(chǔ)備膠（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml
10% SDS 100ul
10%過(guò)硫酸銨（APS） 100ul
TEMED 8ul
1%明膠（1g明膠-->100ml，37°C水浴溶解） 0.5ml
B.濃縮膠的配制
濃縮膠 6ml
ddH2O 4.5ml
30%儲(chǔ)備膠 0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml
10% SDS 60ul
10%過(guò)硫酸銨 60ul
TEMED 6ul
（3）5×Tris �甘氨酸電極緩沖液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
（4）4 ×上樣緩沖液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2） 8ml
16%甘油 3.2 ml
溴酚藍(lán) 0.024g
ddH2O 2.4ml
(5) 洗脫液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分鐘兩次，中間換液）
（6）漂洗液： 50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分鐘2次）
（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小時(shí)）
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮藍(lán) R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小時(shí)）
（9）脫色液A、B、C：甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5% （分別30min、1h、2h脫色）
實(shí)驗(yàn)步驟
1.取對(duì)數(shù)期的癌細(xì)胞在的無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)24h。
2.次日收集上清液，將上清液移入離心管中 2000rpm 離心10min，-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/div>
3.根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度（或者測(cè)定蛋白濃度調(diào)整使所上蛋白總量一致）。與5×上樣緩沖液混合，13ul樣本+4ul上樣緩沖液。（不要用槍用力吹打，防止出現(xiàn)過(guò)多氣泡）
4.配制分離膠和濃縮膠，16ul/孔上樣（根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度和蛋白濃度確定上樣量），4℃進(jìn)行SDS-PAGE 電泳100v約1.5小時(shí)（電泳時(shí)在周圍敷上冰，有利于使條帶跑直）。
5.電泳結(jié)束后,將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振蕩洗脫2次,每次40分鐘,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脫液) 漂洗2次,每次20分鐘,接著,將凝膠置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6.孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.05% Coomassic 亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10 % ,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5%) 分別脫色0.5、1、2h后，顯示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD）為位于藍(lán)色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積，寬度和灰度值，做統(tǒng)計(jì)分析。
注意事項(xiàng)：
1.制備聚丙烯酰胺時(shí)應(yīng)注意排除氣泡 。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液 配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)有絮狀物，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因?yàn)闀?huì)改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6.明膠要4度保存，配好后1周內(nèi)使用
凝膠制備：
1.玻璃板對(duì)齊后放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。
2.配10%分離膠，APS和TEMED作用為促凝，最后灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，并用吸水紙洗凈后灌膠，灌至大約3/4處，上面加滿水壓平。
3.配濃縮膠，同樣地，APS和TEMED最后加，分離膠灌入約30min后觀察小燒杯中剩余分離膠是否已凝，同時(shí)仔細(xì)觀察可見(jiàn)玻板水和膠間有一條折線，說(shuō)明膠已凝固。
4.將上面的水倒去，吸水紙洗凈，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然后將梳子插入，注意保持水平，約30min后凝固可用。
5.拔梳子在電泳緩沖液中拔，加樣孔用小針筒沖洗干凈再上樣，注意上樣時(shí)勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時(shí)要輕，不要產(chǎn)生氣泡，否則加樣時(shí)易導(dǎo)致逸出而使結(jié)果不準(zhǔn)確。
編輯：songjiajie2010
分享:
