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支原體培養的操作與方法

放大字體  縮小字體 發布日期:2013-11-15  來源:實驗室資訊網
核心提示:支原體常用培養基為PPLO,很多公司都有出售.但血清 (常用馬血清或豬血清)和抗生素(醋酸跎)你要自己加.你可以查查.還有改良的Frey#
 支原體常用培養基為PPLO,很多公司都有出售.但血清 (常用馬血清或豬血清)和抗生素(醋酸跎)你要自己加.你可以查查.還有改良的Frey's培養基,常用的微生物實驗技術書上都可以查到的。可以自己配制的。在液體培養基中通常要加入酚紅做指示劑的,當培養基由紅色變為黃色時,即可判定支原體的生長程度。要強調一點,支原體的分離可能不太容易,那么要多盲傳幾代。液體培養基變黃后,在固體培養基上單克隆,以純化分離的菌。
所有解脲,人型,肺炎,生殖道支原體培養基 ,均為液態,不知道homiao要分離哪種支原體,需要哪種支原體?
1、培養 :支原體的培養37℃即可,當然,初次培養37℃,5%-10%co2效果更好。其中,解脲支原體生長比較快,用我所培養基,接種量104- 105ccu,培養16-18h即可達到對數生長期。人型,肺炎,24-48h即可達到對數生長期。
2、鑒定:主要靠菌落染色、生化反應及特異性生長抑制試驗等.
(1)Dienes菌落染色  Dienes染色液:  美藍 2.5g  天青-Ⅱ 1.5g   麥芽糖 10g   碳酸鈉 0.5g   蒸餾水 100ml
染色時,直接吸染色液覆蓋菌落,1min后,用生理鹽水洗去染色液,低倍鏡下可見支原體菌落呈藍色,而其他菌菌落不著色。
(2)生化反應
根據不同采樣部位及對底物的分解或者作為能源,可以鑒別不同支原體。
解脲支原 分解尿素不分解精氨酸,生成NH3使培養基的ph升高,酚紅指示劑變紅。
人型支原體分解L-精氨酸不分解尿素,生成NH3使PH值升高,酚紅指示劑變紅。
肺炎和人型支原體分解葡萄糖,使pH降低,酚紅指示劑由紅變黃。
(3)在含0.002%美藍的培養基中肺炎支原體能生長且將美藍還原而退色,其他口腔、唾液或發酵支原體均被抑制生長,此法可鑒定肺炎支原體。
(4)分子生物學鑒定
由于支原體的基因文庫已建立,通過pcr擴增和基因探針技術可以對支原體進行鑒定。
如果要自己配制培養基,現提供幾種配方:
基礎培養基:Hayflick培養基(PPLO培養基),牛心粉 50g 蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 加14g瓊脂粉為固體培養基
(1) 肺炎支原體培養基
基礎培養基 70ml  牛血清 (滅活) 20ml  25%的酵母浸液 10ml  50%葡萄糖 1-2ml 0.4  酚紅 0.5ml  制霉素 0.001g  青霉素 10萬IU  pH 7.8
(2)人型支原體培養基
基礎培養基 70ml  馬血清 20ml 25%的酵母浸液 10ml  30%L-精氨酸 0.33ml  0.4%酚紅 0.5ml  制霉素 0.001g  青霉素 10萬IU  pH 6.3
(3)解脲支原體培養基
基礎培養基 70ml  馬血清 20ml  25%的酵母浸液 10ml  30%尿素0.33ml  0.4%酚紅 0.5ml  制霉素 0.001g  青霉素 10萬IU   pH 6.0
注:由于支原體能在人工培養基上生長,但是營養要求較高,需要提供膽 固醇和酵母才能生長。以上配方中,馬(牛).血清提供膽固醇,酵母浸液提供酵母。
編輯:songjiajie2010

 
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