單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體，稱為菌落。當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔。不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落或菌苔一般都具有穩(wěn)定的特征，可以成為對該微生物進行分類、鑒定的重要依據(jù)。大多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、以及許多真菌和單細(xì)胞藻類能在固體培養(yǎng)基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養(yǎng)。所謂平板，即培養(yǎng)平板的簡稱，它是指固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛固體培養(yǎng)基的平皿。這方法包括將單個微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。

首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時間即可出現(xiàn)菌落。如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。

因為將微生物懸液先加到較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個菌落（圖1）。

最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，即用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行連續(xù)劃線（圖2），微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。有時這種單菌落并非都由單個細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

用固體培養(yǎng)基分離嚴(yán)格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露于空氣中不立即死亡，可以采用通常的方法制備平板，然后置放在封閉的容器中培養(yǎng)，容器中的氧氣可采用化學(xué)、物理或生物的方法清除。對于那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養(yǎng)的分離則可采用稀釋搖管培養(yǎng)法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一只滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一只毛細(xì)管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養(yǎng)皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。

 

 

大多數(shù)細(xì)菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數(shù)種類在固體培養(yǎng)基上長得很好。然而迄今為止并不是所有的微生物都能在固體培養(yǎng)基上生長，例如一些細(xì)胞大的細(xì)菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。

稀釋法是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。接種物在液體培養(yǎng)基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的機率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)（一般應(yīng)超過95%）表現(xiàn)為不生長。

 

 

只能分離出混雜微生物群體中占數(shù)量優(yōu)勢的種類是稀釋法的一個重要缺點。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數(shù)。這時，可以采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細(xì)胞（或單孢子）分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細(xì)菌則較難。

較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個個體，并在大量的滅菌培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移清洗幾次，除去較小微生物的污染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細(xì)胞分離，例如將經(jīng)適當(dāng)稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細(xì)胞的液體來進行純培養(yǎng)物的分離。單細(xì)胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

 

 

沒有一種培養(yǎng)基或一種培養(yǎng)條件能夠滿足一切微生物生長的需要，在一定程度上所有的培養(yǎng)基都是選擇性的。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設(shè)計特定環(huán)境使之適合這種微生物的生長，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養(yǎng)出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只占少數(shù)。這種通過選擇培養(yǎng)進行微生物純培養(yǎng)分離的技術(shù)稱為選擇培養(yǎng)分離，特別適用于從自然界中分離、尋找有用的微生物。自然界中，在大多數(shù)場合微生物群落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其它微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法。或抑制使大多數(shù)微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環(huán)境，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養(yǎng)分離。

根據(jù)待分離微生物的特點選擇不同的培養(yǎng)條件，有多種方法可以采用。例如要分離高溫菌，可在高溫條件下進行培養(yǎng)；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細(xì)菌、藍細(xì)菌等能在瓊脂平板表面或里面滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開。可將微生物群落點種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反復(fù)進行，得到純培養(yǎng)物。

富集培養(yǎng)法原理和方法非常簡單，利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，很容易地分離到所需的特定微生物。富集條件可根據(jù)所需分離的微生物的特點從物理、化學(xué)、生物、及綜合多個方面進行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養(yǎng)等等許多方面。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。

 

 

分離的目的通常是要得到純培養(yǎng)。然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養(yǎng)物作為純化培養(yǎng)的替代物。含有二種以上微生物的培養(yǎng)物稱為混合培養(yǎng)物，而如果培養(yǎng)物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。例如二元培養(yǎng)物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細(xì)胞生物的嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物。有一些具有細(xì)胞的微生物也是嚴(yán)格的其它生物的細(xì)胞內(nèi)寄生物，或特殊的共生關(guān)系。對于這些生物，二元培養(yǎng)物是在實驗室控制條件下可能達到的最接近于純培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。另外，獵食細(xì)小微生物的原生動物也很容易用二元培養(yǎng)法在實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。