手機(jī)版
RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條 RNA 鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板：
1. 引物：逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers和基因特異性引物（GSP）。其中Oligo（dT)具有12-20個(gè)T堿基，并且與真核生物mRNA的3’Poly A尾配對，可合成全長的cDNA，但僅擴(kuò)增有polyA尾的mRNA ，對模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實(shí)驗(yàn)。而Random Primers具有6-9個(gè)堿基，可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)。基因特異性引物可以識(shí)別特定模板序列，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇。
2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：一種是來自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的RNaseH活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3，在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的RNaseH的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH活性，最適溫度37℃，最適pH7.6，較弱的RNaseH活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。
3.RNA模板：通常利用紫外分光光度計(jì)檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1,A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整度，完整的總RNA在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S和18S rRNA條帶（真核樣品），28S rRNA條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA條帶的兩倍，并且無gDNA和蛋白殘留。
1. 引物：逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers和基因特異性引物（GSP）。其中Oligo（dT)具有12-20個(gè)T堿基，并且與真核生物mRNA的3’Poly A尾配對，可合成全長的cDNA，但僅擴(kuò)增有polyA尾的mRNA ，對模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實(shí)驗(yàn)。而Random Primers具有6-9個(gè)堿基，可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續(xù)qPCR實(shí)驗(yàn)。基因特異性引物可以識(shí)別特定模板序列，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇。
2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：一種是來自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的RNaseH活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3，在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的RNaseH的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH活性，最適溫度37℃，最適pH7.6，較弱的RNaseH活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。
3.RNA模板：通常利用紫外分光光度計(jì)檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1,A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整度，完整的總RNA在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S和18S rRNA條帶（真核樣品），28S rRNA條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA條帶的兩倍，并且無gDNA和蛋白殘留。
