通過對熒光光譜的研究，可以獲得蛋白質分子中熒光生色基團的種類、結構和所處微環境及其分布情況等有用信息，同時還可以得到外源物質與生物大分子相互作用的有關數據。目前已有多篇文獻采用熒光光譜法研究藥物分子如槲皮素[3 ] 、甲基硫菌靈[4 ] 等與血清白蛋白的相互作用。

 

      核黃素(Riboflavin ，RI) 又稱維生素B2 ，是人體必需的13 種維生素之一，具有促進發育和細胞的再生；促使皮膚、指甲、毛發的正常生長；消除口腔內、唇、舌的炎癥；減輕眼睛的疲勞增進視力，協助代謝碳水化合物、脂肪、蛋白質等多種功能。同時還具有利尿消腫，防治腫瘤，降低心腦血管病的發生等保健功效。

 

      本文采用熒光光譜法研究了核黃素與牛血清白蛋白(BSA) 間的相互作用，探討了核黃素與BSA 作用機制，計算得到熒光猝滅常數，以及與BSA 作用的結合常數和結合位點數等信息。

 

      1 　實驗部分

 

      1. 1 　試劑與儀器

 

      RF25301 型熒光分光光度計(日本，島津公司) ；UV28453 型紫外分光光度計(日本，日立公司) ； TB285型恒溫水浴(日本，島津公司) ；p HSJ24A p H 計(上海雷磁儀器廠) 。

 

      牛血清白蛋白(Amresco. 0930 ，分子量:65 000) ；核黃素(中國藥品生物制品檢定所) ；p H = 7. 40 的Tris2HCl 緩沖溶液；以Tris2HCl 緩沖溶液為溶劑配制1. 0 ×10 - 3 mol•L - 1 的BSA 標準溶液，1. 0 ×10 - 3mol•L - 1 核黃素標準溶液，兩種標準溶液均在0～4 ℃冰箱中保存。實驗所需濃度由此稀釋而得。Tris ，HCl ，NaCl均為分析純；水為雙重蒸餾水_。

 

      1. 2 　實驗方法

 

      在10 mL 比色管中依次加入p H = 7. 40 的Tris2HCl 緩沖溶液2 mL ，1. 0 ×10 - 3 mol/ L BSA 溶液0. 5mL 以及一定量核黃素溶液，用0. 1 mol/ L NaCl水溶液稀釋至刻線后混勻，在實驗溫度下恒溫1 h ，采用1 cm石英池，激發波長為285 nm ，繪制300～450 nm 的熒光光譜，并分別以△λ= 60 nm 和△λ= 15 nm 掃描其同步熒光光譜，測定時入射狹縫均為10 nm ，出射狹縫均為5 nm。

 

      2 　結果與討論

 

      2. 1 　熒光猝滅光譜

 

      按照實驗方法測定不同溫度條件下BSA 溶液中加入不同量核黃素的熒光光譜(圖1) 。

 

      由于蛋白質中存在色氨酸和酪氨酸，使其具有內源熒光，由圖1 可知:當固定BSA 的量，隨著核黃素濃度的增加，BSA 的熒光強度不斷降低，熒光峰逐漸藍移，說明核黃素與BSA 發生了相互作用，這種作用可能引起BSA 中熒光發色團的微環境及蛋白質分子構象行為的變化[5 ] 。進一步研究發現在293 K 和310 K條件下加入核黃素的濃度與BSA 熒光猝滅值△F( △F = F0 - F， F、F0 分別指有無RI 時的熒光強度) 分別在0～0. 6 ×10 - 5 mol/ L 、0～0. 4 ×10 - 5 mol/ L 范圍內呈良好的線性關系，回歸系數R 分別為0. 9982 、0. 9938 ，該法可用于核黃素濃度的測定。

 

      2. 2 　熒光猝滅機理及結合常數的基本確定

 

      引起BSA 熒光猝滅的原因可能有動態猝滅和靜態猝滅兩種。動態猝滅過程遵循Stern2Volmer 方程[6 ] 。

 

      F0 / F = 1 KSV [Q ] = 1 Kqτ0 [Q ] (1)

 

      式中， F0 和F 分別表示不存在和存在猝滅劑物質的熒光強度； [Q ]為猝滅劑的濃度， KSV為動態猝滅常數，Kq是由擴散過程控制的雙分子動態猝滅速率常數[7 ] 。τ0 為沒有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約為10 - 8 s[8 ] 。而靜態猝滅過程遵循下式:

 

      F0 / F = 1 KS [Q ] (2)

 

      式中， KS 是靜態猝滅常數。隨溫度的升高動態猝滅常數會增大，而靜態猝滅常數隨之減小，可由此判斷熒光猝滅類型。

 

      根據Stern2Volmer 方程繪制不同溫度下的( F0 / F - 1) ～[Q ]曲線，結果顯示，隨溫度升高曲線斜率增大，表明猝滅機理為動態猝滅。表1 為不同溫度核黃素對BSA 熒光猝滅的Stern2Volmer 方程及猝滅常數。各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數約為2 ×1010 L•mol- 1 •s - 1 ，而從表1 結果來看，Kq數量級在1013 ( Kq= KSV /τ0 ) ，由此可知，猝滅機理似乎應為靜態猝滅，但考慮到離子強度是影響猝滅系數的重要因素，實驗采用0. 1 mol•L - 1NaCl 以控制溶液離子強度，我們認為Kq的增大可能是離子強度影響的結果[9 ] 。

 

      為驗證核黃素對BSA 熒光的猝滅機理，測定了1. 0 ×10 - 5 mol•L - 1 BSA (以去離子水為參比) 和核黃素與BSA等摩爾混合物的吸收光譜圖(以核黃素溶液作參比) ，兩者幾乎完全重合，表明核黃素的加入并未使BSA 的紫外吸收光譜發生變化。進一步證實核黃素對BSA 熒光猝滅機理是其與BSA 激發態分子生成瞬時的激發態復合物的動態猝滅過程而不是與BSA 在基態時生成不發光的配合物所產生的靜態猝滅過程[10 ] 。

 

      2. 3 　BSA 與核黃素結合反應的熱力學性質及作用力

 

      分子間的作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力，疏水作用力等。當溫度變化不大時，反應的焓變△r Hm可認為是常數。由熱力學公式In ( K2 / K1 ) = △r Hm(1/ T1 - 1/ T2 ) R ； △r Gm= RTInK； △rSm =( △r Hm- △r Gm) / T。分別計算出溫度為293 K，310 K 時，核黃素與BSA 作用的自由能變△r Gm、焓變△r Hm和熵變△r Sm分別為- 28. 80 kJ •mol- 1 ，4. 406 kJ •mol- 1 ，0. 113 kJ •mol- 1 及- 30. 732 kJ •mol- 1 ，4. 406 kJ •mol- 1 ，0. 113 kJ•mol- 1 。

 

      核黃素與BSA 的熱力學參數△r Hm> 0 和△r Sm> 0 ，根據Ross 等總結出的判斷生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的熱力學規律[11 ] 推斷出核黃素與BSA 之間的主要作用力是疏水作用。

 

      2. 4 　核黃素與BSA 的表觀結合常數Kb 以及結合位點數n

 

      當小分子與大分子結合時其表觀結合常數Kb 與結合位點數n 由下式求出:

 

      lg[ ( F0 - F) / F] = lgKb nlg[Q ]

 

      分別在293 K， 310 K溫度下做lg ( F0 - F) / F - lg[Q ]的雙對數圖，根據截距和斜率求得不同溫度的Kb 和n ，如表2 。

 

      由表2 可知，在293 K、310 K核黃素與BSA 的n 接近1 ， Kb 值為105 數量級，說明核黃素與BSA 具有一個結合位點數。核黃素與BSA 有較強的結合作用可以被蛋白質運輸和儲存。

 

      2. 5 　同步熒光光譜

 

      △λ= 15 nm 的同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的光譜特征， △λ= 60 nm 的同步熒光光譜僅顯示色氨酸殘基的光譜特征[12 ] 。圖2 為固定BSA 濃度改變核黃素濃度所做的同步熒光光譜圖。由圖可知酪氨酸殘基，色氨酸殘基特征熒光光譜峰均隨著核黃素濃度增加產生猝滅，同時峰位值均發生了紅移，說明酪氨酸殘基，色氨酸殘基所處的微環境疏水性降低，親水性增強。色氨酸殘基的熒光降低比酪氨酸殘基更顯著且與BSA 的熒光性質相近，說明BSA 的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻，核黃素與BSA 的結合位點更接近于色氨酸殘基。