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PCR基因擴增

放大字體  縮小字體 發布日期:2013-05-10
核心提示:[實驗目的]通過本實驗學習PCR反應的基本原理與實驗技術。[實驗原理]多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)的原理類似
 [實驗目的]
通過本實驗學習PCR反應的基本原理與實驗技術。
[實驗原理]
多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)的原理類似于DNA的天然復制過程。在待擴增的DNA片段兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物,經變性、退火和延伸若干個循環后,DNA擴增2n倍。
1.變性:加熱 使模板DNA在高溫下(94℃)變性,雙鏈間的氫斷裂而形成兩條單鏈,即變性階段。
2.退火:使溶液溫度降至50-60℃,模板DNA與引物按堿基配對原則互補結全,即退火階段。
3.延伸:溶液反應溫度升至72℃,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,在引物的引導下,利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTP),按5’→3’方向復制出互補DNA,即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環,即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講,每經過一個循環,樣本中的DNA量應該增加一倍,新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板,經過25-30個循環后DNA可擴增106-109倍。
典型的RCP反應體系由如下組分組成:DNA模板、反應緩沖、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。
[實驗儀器與設備]
1.PCR基因擴增儀
2.瓊脂糖凝膠電泳系統
[實驗材料]
1. DNA模板 2. 4種dNTP
3. 引物1和引物2 4. Taq酶
5. 瓊脂糖 6. DNA Marker
7. tip 8.eppendorf管
9. 微量移液器
附試劑的配制:
1. 10×PCR緩沖液
500mmol/L KCl
100mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室溫)
15mmol/L MgCl2
0.1% 明膠
2. 4×dNTP
10mmol/L dATP
10mmol/L dCTP
10mmol/L dGTP
10mmol/L dTTP
3. Taq酶 1u/μL
4. DNA模板 1ng/μL
5. 引物溶液濃度 10pmol/μL
[實驗步驟]
1.在0.5ml Eppendorf管內配制25μL反應體系
反應物 體積/μL
ddH2O 11
10×PCR緩沖液 2.5
2.5mmol/L dNTP 2.0
25mmol/L MgCl2 1.5
引物1 1.0
引物2 1.0
模板DNA 5
Taq酶 1
混勻,加25μL石蠟油.
2.按下述程序進行擴增
① 94℃預變性 5min
② 94℃變性 1min
③ 52℃退火 1min
④ 72℃延伸 1min
⑤ 重復步驟②-④35次
⑥ 72℃終延伸 10min
3.瓊脂糖凝膠電泳分析RCR結果
配制1.5%瓊脂糖凝膠,取10μL擴增產物電泳。保持電流40mA.電泳結束后,用EB染色15min,紫外燈下觀察結果。
[作業]
根據紫外燈下觀察的結果,畫出電泳示意圖,并討論PCR反應應注意的事項。
[實驗安排]
6學時
1天內可完成,上午做PCR反應,下午做電泳檢測。
 
編輯:songjiajie2010

 
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關鍵詞: PCR基因擴增
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