畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)作為動(dòng)物疫病傳播的源頭，在疫病發(fā)生時(shí)及時(shí)進(jìn)行病原診斷，采取相應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施，是目前動(dòng)物疫病防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
 

目前國(guó)內(nèi)動(dòng)物疫病的病原學(xué)診斷試劑選擇范圍有限。而在通用的血清學(xué)檢測(cè)試劑中，絕大多數(shù)是檢測(cè)血清中抗體的免疫試劑，其結(jié)果更多反應(yīng)了疫苗免疫效果，對(duì)病原感染只能間接分析，無(wú)法確診，何況動(dòng)物在遭受感染后，病毒要在體內(nèi)潛伏一段時(shí)間，動(dòng)物才會(huì)產(chǎn)生抗體，檢測(cè)結(jié)果往往滯后病原感染。能對(duì)野毒感染進(jìn)行鑒別的成熟抗體檢測(cè)試劑只有豬偽狂犬的gE抗體試劑盒，由于疫苗的純化工藝問(wèn)題，口蹄疫的非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體目前無(wú)法產(chǎn)生理論上的鑒別診斷作用。另一方面能監(jiān)測(cè)疫病病原的試劑的商品化試劑偏少。免疫熒光抗體技術(shù)受限于基層養(yǎng)殖場(chǎng)熒光顯微鏡以及熒光標(biāo)記抗體的缺乏，故在多數(shù)基層養(yǎng)殖試驗(yàn)室難以普及。由于達(dá)到市場(chǎng)需求的特異性及靈敏度并能配對(duì)的動(dòng)物疫病抗體的缺乏，免疫試劑中目前的病原檢測(cè)產(chǎn)品很少，這類產(chǎn)品開發(fā)的周期長(zhǎng)，不確定性很大，很難應(yīng)對(duì)基層疫病防控的需要。因此養(yǎng)殖場(chǎng)試驗(yàn)室亟需合適的病原學(xué)檢測(cè)試劑。
 

鑒于基于核酸擴(kuò)增的分子診斷技術(shù)發(fā)展迅速，熒光PCR及電泳PCR已經(jīng)被農(nóng)業(yè)部及各省市疫控單位逐步采用，扭轉(zhuǎn)了疫病診斷中病原診斷技術(shù)空白的態(tài)勢(shì)。但對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)基層試驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，PCR分子診斷技術(shù)的使用存在不少阻礙：
1、分子診斷試劑一般要冷凍保存，成本高且運(yùn)輸半徑有限；
2、核酸提取步驟復(fù)雜緩慢，基層技術(shù)人員操作困難；
3、基層單位無(wú)力購(gòu)買價(jià)格偏高的PCR擴(kuò)增儀，基層技術(shù)人員也不容易掌握儀器操作要領(lǐng)。因?yàn)檫@些難點(diǎn)的存在，分子診斷技術(shù)一直沒(méi)有在我國(guó)養(yǎng)殖基層試驗(yàn)室普及。

快靈生物開發(fā)的基因試紙卡，開啟了現(xiàn)場(chǎng)分子診斷步入養(yǎng)殖場(chǎng)的新時(shí)代。它包括基因提取試劑、恒溫?cái)U(kuò)增試劑及免疫層析試紙卡三部分，能常溫運(yùn)輸；在常溫下同時(shí)完成 DNA/RNA樣品提取，僅需微型離心機(jī)或?qū)＠�磁力�?0分鐘內(nèi)完成操作；添加樣品模板后將反應(yīng)管密閉后放置在變溫金屬浴上保溫60分鐘，擴(kuò)增完成后將反應(yīng)管插入試紙卡槽后一步按壓就啟動(dòng)溶液層析，3-5分鐘后即可目視層析試紙的線條顯色判定結(jié)果。專利申請(qǐng)中的基因試紙卡解決了擴(kuò)增產(chǎn)物溶液及其氣溶膠的泄漏污染導(dǎo)致后續(xù)樣品交叉污染的問(wèn)題，開啟了現(xiàn)場(chǎng)分子診斷步入了基層養(yǎng)殖場(chǎng)的新時(shí)代。基因試紙卡能直接檢測(cè)到病原，很適合對(duì)健康攜毒排毒的動(dòng)物進(jìn)行篩查，也適合對(duì)感染早期的動(dòng)物進(jìn)行確診，大大縮短窗口期。此外，對(duì)于罕見病原或突然爆發(fā)的新病原，只要能在基因庫(kù)中查詢到該病原的基因序列，基因試紙卡能最快在一周內(nèi)研發(fā)出來(lái)。該基因試紙卡的操作過(guò)程以專利磁力架，變溫金屬浴，兩支移液槍為例說(shuō)明如下圖。

1.簡(jiǎn)單快速提取核酸：快靈生物的核酸提取試劑在常溫下10分鐘內(nèi)能同時(shí)完成樣品中DNA與RNA的提取。目前基因變異最快，危害性最大的疫病往往都是RNA病毒引起的。其他商業(yè)化RNA病毒提取試劑一般要求在低溫冷凍條件下提取操作，基層單位往往無(wú)法實(shí)現(xiàn)。快靈生物經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次的實(shí)驗(yàn)摸索，終于配制了獨(dú)特的基因提取試劑，僅需微型高速離心機(jī)或?qū)＠�磁力架�?0分鐘內(nèi)就能完成單份樣品的核酸提取。我們已經(jīng)在細(xì)菌病毒樣品，全血與組織樣品分別進(jìn)行了DNA、RNA的提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果都很良好。簡(jiǎn)單的RNA提取試劑是基因試紙卡步入基層應(yīng)用的基礎(chǔ)。

2. 擴(kuò)增核酸的高靈敏高特異的快速免疫檢測(cè)技術(shù)：快靈生物通過(guò)膠體金試紙實(shí)現(xiàn)了基因擴(kuò)增產(chǎn)物的高靈敏高特異檢測(cè)。膠體金試紙具有極高的的檢測(cè)靈敏度，如克倫特羅的產(chǎn)品能達(dá)到納克級(jí)別（單位ng/ml），而基因擴(kuò)增技術(shù)則可以迅速將超痕量的靶基因特異擴(kuò)增百萬(wàn)倍。快靈生物將膠體金技術(shù)與基因擴(kuò)增技術(shù)完美結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了高靈敏的核酸檢測(cè)。我公司對(duì)照試驗(yàn)表明，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)微弱信號(hào)時(shí)，快靈生物的基因試紙卡對(duì)稀釋100倍的擴(kuò)增產(chǎn)物仍有明顯信號(hào)。當(dāng)LAMP恒溫?cái)U(kuò)增溶液采用染料（如SYBR Green I）只能檢測(cè)到微弱信號(hào)時(shí)，快靈生物基因試紙卡對(duì)100倍稀釋后的擴(kuò)增溶液仍有明顯信號(hào)。因此基因試紙卡能實(shí)現(xiàn)更高靈敏度的信號(hào)檢測(cè)，或者在同樣的產(chǎn)物濃度下，能保證更好的信號(hào)判別。更重要的是染料檢測(cè)方法沒(méi)有特異性，只要溶液中存在一定濃度的核酸就有信號(hào)，無(wú)法區(qū)分信號(hào)是來(lái)自特異性擴(kuò)增產(chǎn)物還是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。而基因試紙卡的檢測(cè)則是引物與探針雙重保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，能很好地區(qū)分非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。

3. 精致的防污染基因試紙卡：快靈生物專利申請(qǐng)中的防污染基因試紙卡，是目前解決基層單位基因擴(kuò)增產(chǎn)物污染的最佳方案。盡管在熒光定量PCR和LAMP等方法中，可以不開蓋檢測(cè)，但其使用的反應(yīng)管并沒(méi)有嚴(yán)格密封的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，滲漏與意外開蓋仍然可能導(dǎo)致污染。快靈生物專利申請(qǐng)中的防污染基因試紙卡的塑料套件中存在多級(jí)密封設(shè)計(jì)，并能承受一定的空氣壓力差，反應(yīng)管內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物被封存在試紙卡中，即使層析試紙上的擴(kuò)增產(chǎn)物形成了氣溶膠也無(wú)法擴(kuò)散出來(lái)。

4. 一步操作的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)：快靈生物采用了一步操作的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，適合基層單位操作人員使用。近年開發(fā)出了多種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，有些技術(shù)需要進(jìn)行多步操作才實(shí)現(xiàn)核酸（DNA或RNA)的擴(kuò)增。快靈生物公司綜合了LAMP技術(shù)與RCA技術(shù)的特點(diǎn)，獨(dú)創(chuàng)了新型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能一次添加相關(guān)試劑與樣品后，在50℃/64℃兩個(gè)溫度下共反應(yīng)60分鐘就能達(dá)到層析試紙需要的信號(hào)濃度。

5. 基因試紙卡的常溫運(yùn)輸：快靈生物的基因試紙卡檢測(cè)盒中的試劑與物料都能在常溫下運(yùn)輸，解決了基因檢測(cè)試劑對(duì)基層單位的物流障礙。目前絕大部分的基因檢測(cè)試劑都需要在-20℃的條件下采用干冰運(yùn)輸，使得產(chǎn)品的配送和使用極為不便。作為農(nóng)牧業(yè)的基層單位，出于疫病防控的需要，畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)往往地處郊區(qū)或偏遠(yuǎn)的鄉(xiāng)村。基因檢測(cè)試劑的常溫運(yùn)輸，是基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)入這些基層單位的先決條件。快靈產(chǎn)品則采用獨(dú)有的保護(hù)劑，對(duì)檢測(cè)試劑中不易保存的成分進(jìn)行凍干固化，完全實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品的常溫運(yùn)輸，給廣大養(yǎng)殖場(chǎng)開啟了基因檢測(cè)技術(shù)的大門。

6. 最適應(yīng)基層人員使用的方案：快靈生物的基因試紙卡檢測(cè)盒的全流程操作簡(jiǎn)單方便，即使中學(xué)文化人員經(jīng)簡(jiǎn)單培訓(xùn)就能掌握。因此對(duì)廣大的基層單位客戶，采用基因試紙卡進(jìn)行疫病檢測(cè)，完全不需要額外招聘專業(yè)的技術(shù)人員。同時(shí)基因試紙卡所需配套儀器只有微型高速離心機(jī)或?qū)＠�磁力架，變溫金屬浴和兩支移液槍，需要的配置費(fèi)用較低，絕大部分的基層單位都能負(fù)擔(dān)得起。