一、食品中蛋白含量測定的意義

蛋白質（protein）是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。人體內酸堿平衡、水平衡的維持，遺傳信息的傳遞、物質的代謝及轉運都與蛋白質有關。人及動物只能從食物中得到蛋白質及其分解產物來構成自身的蛋白質，因此蛋白質是人體的重要營養物質，也是食品中重要營養指標。

在各種食品中，蛋白質的含量各不相同。測定食品中蛋白含量，對評價食品的營養價值，合理開發利用食品資源、提高產品質量、優化食品配方、知道經濟核算及生產過程控制均具有極其重要的意義。

二、蛋白質的組成及結構

  蛋白質是由C（碳）、H（氫）、O（氧）、N（氮）組成，一般蛋白質可能還會含有P（磷）、S（硫）、Fe（鐵）、Zn（鋅）、Cu（銅）、B（硼）、Mn(錳)、I（碘）、Mo（鉬）等。這些元素在蛋白質中的組成百分比約為：碳50% ，氫7% ，氧23% ，氮16% ，硫0~3% 及其他微量元素。一切蛋白質都含N元素，且各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16%。蛋白質系數：任何生物樣品中每1gN的存在，就表示大約有100/16=6.25g蛋白質的存在， 6.25常稱為蛋白質常數。
  蛋白質是以氨基酸為基本單位構成的生物高分子。蛋白質分子上氨基酸的序列和由此形成的立體結構構成了蛋白質結構的多樣性。蛋白質具有一級、二級、三級、四級結構，蛋白質分子的結構決定了它的功能。
  氨基酸是構成蛋白質的基本單元，蛋白會約含有20種氨基酸，在細胞質中的核糖體上，將氨基酸分子互相連接成肽鏈。一個氨基酸分子的氨基和另一個氨基酸分子的羧基，脫去一分子水而連接起來，這種結合方式叫做脫水縮合。通過縮合反應，在羧基和氨基之間形成的連接兩個氨基酸分子的那個鍵叫做肽鍵。由肽鍵連接形成的化合物稱為肽。

三、蛋白質的檢測原理

圖2半微量法測蛋白

不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的。

1 消化：

樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。并破壞有機物，使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，與硫酸結合成硫酸銨，留在酸性溶液中。

2 消化過程中：

在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應生成硫酸氫鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸加熱沸點330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達400℃，加速了整個反應過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。

為了加速反應過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。所以有機物全部消化后，出現硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應指示劑。

3 蒸餾：

樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

4 吸收與滴定：

蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸溶液進行氨的吸收，然后再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標準鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應，它有吸收氨的作用。
 
四、步驟

準確稱取樣品中0.50-2.00g→于500ml凱氏瓶中→加10g無水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通風櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，將瓶子搖動一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續消化30分鐘→至到樣液呈綠色狀態，停止消化，冷卻→加200ml水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在凱氏瓶中加波動珠數粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加熱→至凱氏瓶內殘液減少到三分之一時，取出用水沖洗→用0.1N HCl滴定。

五、注意事項

1 樣品應是均勻的，若是固體樣品應事先研細過篩，液體樣要混合均勻。

2 樣品放入凱氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。

3 如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對于縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

4 有機物分解需要H2SO4量，H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g樣品  K2SO4：H2SO4=7g：12ml 這種比例在國內外都使用，是公認的。

還有一種比例： K2SO4：H2SO4=10 g：20ml

5 消化時，如不容易呈透明溶液，可將凱氏燒瓶放冷后，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。

6 在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

7 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。

8 消化劑綠色后繼續消化30分鐘即可

9 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。

10 氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。

11 向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現褐色沉淀。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。

12 蒸餾加NaOH是50%，加的量為H2SO4量的4倍，硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48ml，而且一般高于這個理論值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強酸，使顏色變紅。

13 目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險期間一般用4%。