1.消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。并破壞有機物，使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，與硫酸結合成硫酸銨，留在酸性溶液中。

在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應生成硫酸氫鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸加熱沸點330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達400℃，加速了整個反應過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。

為了加速反應過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。

所以有機物全部消化后，出現硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應指示劑。

2.蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

3.吸收與滴定：蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸溶液進行氨的吸收，然后再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量（AOAC方法）。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標準鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應，它有吸收氨的作用。

蛋白質檢測注意事項

1.樣品應是均勻的，若是固體樣品應事先研細過篩，液體樣要混合均勻。

2.樣品放入凱氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。

3.使用自動凱氏定氮儀在檢測樣品前需做空白試驗對照。

4.有機物分解需要H2SO4量，H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g樣品  K2SO4：H2SO4=7g：12ml，這種比例在國內外都使用，是公認的，還有一種比例：K2SO4：H2SO4=10 g：20ml。

5.對于蛋白質含量較高或者含量特別低的樣品需要適當減少或增加稱樣量，以免造成誤差。

6.在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。對于水分或者脂肪含量較高的樣品，消化溫度宜逐漸增加。如果直接增加至420℃容易造成樣品飛濺至消化管壁從而導致消化不完全，使實際檢測結果偏低。

7.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。

8.消化劑綠色后繼續消化30分鐘即可。

9.混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。

10.自動凱氏定氮儀屬貴重儀器，操作完成后及時做好清洗工作并定期保養。

11.向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現褐色沉淀。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。

12.濃硫酸屬強酸且腐蝕性較強，在操作過程中需注意安全，充分做好自我保護措施。如防毒面具、手套、護目鏡等。

13.目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在2%即可將氨完全吸收。

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