對于糖的測定方法有很多,大致可分為三類
1.物理法,(1.旋光法, 2 .折光法, 3.比重法,)
2.物理化學法,(1.點位法, 2極普法, 3.光度法, 4.色譜法)
3.化學方法,(1.斐林氏法. 2.高錳酸鉀法. 3.碘量法. 4.鐵氰化鉀法. 5.蒽銅比色法. 6.咔唑比色法)
共計三大種,在測定其他碳水化合物時,往往是使其水解為糖再進行測定。
一. 總糖的測定
食品中的總糖主要指具有還原性的葡萄糖,果糖,戊糖,乳糖和在測定條件下能水解為
還原性的單糖的蔗糖(水解后為1分子葡萄糖和1分子果糖),麥芽糖(水解后為2分子葡萄糖)以及可能部分水解的淀粉(水解后為2分子葡萄糖)。還原糖類之所以具有還原性是由于分子中含有游離的醛基(-CHO)或酮基(=C=O)。
測定總糖的經典化學方法都是以其能被各種試劑氧化為基礎的。這些方法中,以各種根據斐林氏溶液的氧化作用的改進法的應用范圍最廣。在這里我們主要給大家介紹鐵氰化鉀法,蒽銅比色法,斐林氏容量法。斐林氏容量法由于反應復雜,影響因素較多,所以不如鐵氰化鉀法準確,但其操作簡單迅速,試劑穩定,故被廣泛采用。蒽銅比色法要求比色時糖液濃度在一定范圍內,但要求檢測液澄清,此外,在大多數情況下,測定要求不包括淀粉和糊精,這就要在測定前將淀粉,糊精去掉,這樣就使操作復雜化,限制了其廣泛應用。
(一) 鐵氰化鉀法
1.原理:樣品中原有的和水解后產生的轉化糖都具有還原性質,在堿性溶液中能將鐵氰化鉀還原,根據鐵氰化鉀的
濃度和檢驗滴定量可計算出含糖量。其反應為下:
C6H12O6+6K3[Fe(CN)6] + 6KOH →(CHOH)4·(COOH)2 + 6K4[Fe(CN)6]+ 4H2O
滴定終了時,稍過量的轉化糖即將指示劑次甲基蘭還原為無色的隱色體。
2,試劑
1)1%的次甲基蘭指示劑
2)鹽酸(水解作用)
3)10%和30%的NaOH溶液
4)1%鐵氰化鉀(貯存特色瓶,臨用前標定)
標定步驟
稱蔗糖1.0000g→定容500ml→取此液50ml→于100ml容量瓶→加hcl5ml→搖勻→65-70℃水裕15分鐘→取出冷卻→用30%NaOH中和→加水于刻度→倒入滴定管中→取10ml1%鐵氰化鉀于錐形瓶中→加10%NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠顆粒→加熱至沸→保持一分鐘→加次甲基蘭1滴→立即以糖液滴足至藍色退去為止,記錄用量。
正式滴定比較滴定時少0.5ml糖液,煮沸1分鐘,加指示劑一滴,再用糖液滴定至蘭色褪去,計算鐵氰化鉀溶液的濃度。
A=(W·V)/(1000×0.95)
A:相當于10ml鐵氰化鉀溶液的轉化糖的量(克)
V:滴定時消耗的糖液的體積
W:稱取純蔗糖的量
1000:稀釋比
0.95:換算等數
3.操作方法
稀釋10g→用100ml水作溶液→于250ml容量瓶→加20%醋酸鉛10ml→至沉淀完為止→加10ml10%NA2HPO4→至不在產生沉淀為止→加水至刻度→過濾-取濾液50ml→于100ml容量瓶中→按鐵氰化鉀標定法進行轉化,中和及滴定
計算糖含量
總糖(以轉化糖計%)= (A × 1000)/(W·V)× 100
A:相當于10ml鐵氰化鉀溶液的轉化糖的重量,
W:樣品的重量
V:滴定時樣液消耗的體積
4.實驗應注意
(a)達終點時,過量的轉化糖將指示劑次甲基蘭還原為無色的隱色體,隱色體容量受空氣中氧所氧化,很快又變
成指示劑的顏色。
(b)整個過程應在低溫電爐上進行,滴定要速度,否則終點不明顯
(c)糖與硫酸反應脫水生成羥甲基呋喃甲醛,生產物再與蒽銅縮合成蘭色化合物,其顏色深淺與溶液中糖的濃度
成正比,單、雙糖等糖類都直接于試劑發生作用,因此不需要水解。
(二)蒽銅的比色法
1.原理:糖與硫酸反應脫水生成羥甲基呋喃甲醛,生產物再與蒽銅縮合成蘭色化合物,其顏色深淺與溶液中糖的濃
度成正比,可比色定量。
2.試劑
(1) 硫酸鋅溶液:溶解500g化學純硫酸鋅于500ml水中
(2) 亞鐵氰化鉀溶液:溶解10.6g化學純亞鐵氰化鉀于100ml水中
(3) 0.2%蒽銅試劑:溶解蒽銅0.2g于100ml95%硫酸中,置棕色瓶中冷暗處保存
(4) 0.1%葡萄糖液:準確稱干燥葡萄糖0.1000g 定容100ml
3.操作方法
(1) 標準曲線繪制
(2) 100ml容量瓶編號
沸水浴加熱6分鐘,取出冷卻→用1cm比色杯→610nm測定吸光度→作出以吸光度為橫坐標,糖液濃度為縱坐標的準
曲線
(3)樣品測定
稱10g樣品→于100ml熱水加入500ml容量瓶中-加硫酸鋅5ml→沸水浴5分鐘→取出再搖動下加亞鐵氰化鉀5ml,→冷卻→定容500ml→過濾→吸濾液25ml→于250ml容量瓶→定容250ml→取稀釋液1ml,于比色管中→加10ml蒽銅試劑→搖勻→水浴加熱6分鐘→冷卻→比色
試驗注意
1,樣液必須清澈透明,加熱后不應有蛋白質沉淀
2,樣品顏色較深時,可用活性炭脫色后再進行測定
3,此法與所用的硫酸濃度和加熱時間有關
4,所取糖液濃度在1-2.5mg/100ml之間
二. 還原糖的測定方法
還原糖包括葡萄糖、果糖、麥芽糖,在葡萄糖分子中含有淤青的醛莖,在果糖分子中含有淤青的酮莖,在乳糖中和
麥芽糖中含有淤青的半縮羧莖,因此都有還原性。在測定還原糖時一般測定總糖時所有將糖類水解為轉化糖再測定
的方法都可用來測定還原糖。
(一)斐林氏容量法
1.此法的原理、試劑、方法與總糖的測定方法相同。只是樣品溶液不必以過轉化,而是直接取濾液進行滴定,濾液進行滴定,濾液中的還原糖含量以在0.2-0.5%為好,又能通過增減樣品量或改變稀釋倍數來調節。10毫升費林氏A、B液混合時理論上相當還原糖量如下:
葡萄糖(無水)果糖或轉化糖尿病 0.0500克
乳糖尿病 0.0678克
麥芽糖 0.0807克
2試劑
(1) 斐林氏A液,稱69.8g cp硫酸銅于100ml水中,過濾備用
(2) 斐林氏B液,稱34.6g.cp濃流鋅鈉和100gcp NaOH于1000ml水中,過濾備用
3方法
稱取樣品10-20g:制備與轉化同鐵氰化鉀法。將樣液倒入滴管中,吸取A,B液準備預滴定
預滴定:
吸A、B液各5ml→從滴管中加15ml樣液→加熱至沸→繼續滴加樣液→至蘭色變潛→加3滴次甲基蘭→在1分鐘內滴定到終點
達到終點時,稍微過量的轉化糖,將蘭色的次甲基蘭染色體還原為無色的隱色體,而顯出氧化亞銅的紅色,去堿性條件下加熱糖的產物是復雜的。
去堿性中斷裂是由于堿度不同,加熱時間不同,生產不等的碎片,這種碎片給后面滴定帶來誤差,而且,這種碎片與糖沒有化合量的關系,所以,Lanecrol-Eynon Method 作出數據檢索表
正式滴定:
吸A,B液各5ml→于三角瓶→加比預定量少0.5-1.0ml樣液→2分鐘內要求沸騰1分鐘→加3滴指示劑→用樣液滴定蘭色消失
總沸騰時間為3分鐘,即滴定在3分鐘完成。
計算:
還原糖=( F·V2)/(W·V1)×100
F:轉還糖回數,即與10ml斐林氏試液相當的轉化糖毫克數,
V1:樣品試液總體積
V2:樣品試液滴定量
W:樣品重量
在測量乳糖制品時,若蔗糖與乳糖的含量比超過3:1時,則應與滴定量中加上相關表中(課本中表9-8)校正值后在進行計算
我們舉例如下:
如果標準果糖溶液度為每100ml溶液含糖262.5mg。對于10ml斐林試液從9-5可以查得果糖液滴定應為20ml。如果不是20ml,可先算出A,B液 校正等數。然后進行計算
再如標準糖溶液濃度為每100ml溶液含糖199.3ml,對于10ml A,B液 從9-4中查到,糖液滴定量應為 25.00ml,若有出入可校正。如果要求不高,可省略校正步驟但要求1%得 測定誤差,則省略校正。另外有時候并未根據檢索表計算樣含糖量,但對A,B液進行標定,以使確定相當得 還原糖量。這種誤差為0.5%。下面我們講標定量A,B液
準確準確稱取烘干冷卻得 A.R蔗糖1.5g→用水溶解稱取250ml容量瓶中→定容→吸50ml于100ml 定量瓶中→加HCL5ml→再65-70攝氏度水裕15分鐘→冷卻→用30%NaOH中和→定容
準確吸A,B液 各5ml于三角瓶中→加水約50ml玻璃珠三粒→加熱至沸→保持1分鐘→加指示劑1滴→再煮1分鐘→立即用糖液滴定至蘭色褪去,紅色出現即為終點
正式滴定,先加入比預滴定時少0.5ml左右得糖液煮沸1分鐘→加指示劑1滴→再煮沸1分鐘→繼續滴至終點
計算: A=W*V/500×0.95
A:相當于10ml斐林氏A、B液的轉化糖的量
W:稱取蔗糖的質量
V :滴定蔗糖的量
500:稀釋比
0.95:換算等數
最后計算:
總糖(還原糖)以轉化糖計%=(A*1000/W*V)*100
A:同上
W:制取樣品的量
V:滴定是時樣品消耗量
1000:是稀釋倍數(100/50*500)
1.預測定的目的:對樣品溶液中還原糖濃度有一定要要求(0.1%左右),測定時樣品溶液的消耗體積應該與標定葡萄糖標液的消耗體積相近,通過測定了解樣品濃度是否合適,濃度過大或過小應該加以調整,使測定時消耗樣品溶液量在10毫升左右;二是通過測定可知道此溶液的大概消耗量,以便在正式的滴定時,預先加入比實際用量少1毫升左右的樣液,只留下1ml左右的樣液在續滴定時加入,以便保證在1分鐘內完成續滴定工作,提交預測定的準確度。
2.此實驗影響測定結果的主要操作因素是反應液堿度、熱源強度,煮沸時間和滴定速度一般煮沸時間短消耗糖多,反之,消耗糖液少,滴定速度過快,消耗糖量多,反之,消耗糖量少。另外溶液堿度愈高,二價銅的還原愈快,因此必須嚴格控制反應的體積,使反應體系堿度一致。熱源一般采用800W電爐,反應液在2秒內沸騰。
(二)KMNO4(高錳酸鉀法)
1.原理,還原糖在堿性溶液中使銅鹽還原成氧化亞銅,在酸性條件下,氧化亞銅能使硫酸鐵還原為硫酸亞鐵,再用KMNO4溶液滴定硫酸亞鐵,即可標出還原糖的量。
2. 操作方法
(1)樣品處理
a. 乳糖:包括乳制品以及含蛋白質的冷食類
稱樣2-5g(液體樣25~50ml)→于250ml容量瓶→加水50ml→加A液10ml+1N NaOH 4ml →定容→靜置30秒→過濾→棄去初液→可測還原糖及蔗糖用。
b. 低酒度飲料:麥精露、各類汽酒等飲料。
先暴氣除CO2→取100ml→于蒸發皿中→用1 N NaOH 中和→沸水浴蒸至原體積四分之→轉入250ml容量瓶→加50ml水→搖勻→(加A液10ml→加1 N NaOH 4ml)→加水至刻度→靜置30秒→過濾。
c. 含多量淀粉的食品:嬰兒食品、糕干粉、寶寶樂、代乳粉、餅干、面包、糕點等
稱樣10-20g→250ml容量瓶→加水200ml→45度水浴加熱1小時→不停搖動→冷后加水至刻度→靜置→吸出清夜200ml于另一容量瓶(250ml)→加A液10ml+1N NaOH 4ml→靜置30秒→過濾。
d. 汽水、果露、國產七種可樂及可口可樂
處理CO2→吸樣液100ml→于250ml容量瓶→加水至刻度→可測還原糖及蔗糖。
(2)測定方法
取50ml處理的樣液→于400ml燒杯→加A、B液各25ml→加熱在4min左右沸騰→再煮2min→趁熱抽濾→用60℃水洗燒杯和沉淀→直到洗液不成堿性→將抽濾的紙(或者石棉)及Cu2O→轉入原來燒杯→用25ml硫酸鐵溶液沖洗抽濾瓶→使沖洗液全部洗入原燒杯中→加水25ml→使Cu2O溶解→用0.1N KMnO4標液滴定至微紅色,同時用50ml水按上述方法做空白實驗。
(3)計算
3. 注意事項:
(1)煮沸后的溶液顯紅色不顯蘭色,則表示糖量高,可減少取樣體積。
(2) 在洗滌Cu2O的整個過程中應使沉淀上層保持一層水層,以隔絕空氣,避免Cu2O被空氣中的氧所氧化。
(3)此法適用于各類食品中還原糖的測定,有色樣液不受限制,準確度高,重現性好。準確性和重現性都優于直接滴定法,但操作復雜、費時,需使用特制的高錳酸鉀法糖類檢索表。
(二)直接滴定法(斐林氏溶液法)
1. 原理
樣品經過處理除去蛋白質等雜質后,加入鹽酸,在加熱條件下使蔗糖水解為還原性單糖,用直接滴定法測定水解后
樣品中的還原糖總量。
2. 試劑
3. 方法
(1) 取過量樣品進行提取,放入250ml容量瓶,加5ml醋酸鋅和5ML亞鐵氰化鋅,定容,靜止30分后過濾,濾液備用。
(2) 測定
樣品預滴定:
取A、B液各5ml于三角瓶中加水10ml,玻璃珠數粒,加熱在2分內沸騰,趁熱滴定,滴定到蘭色褪去,記錄用量。
正式滴定:
取A、B液各5mL于三角瓶→加玻璃珠三粒→從滴定管直接加比預滴定時少0.5-1.0ML樣液,在2分沸騰,趁熱滴定蘭
色褪去,記錄,取三次平均值計算結果。
三.蔗糖的測定
1.原理:樣品除蛋白質后,其中的蔗糖經鹽酸水解轉化為還原糖,用還原糖的測定方法,確定樣品中蔗糖的含
量。
實際上測定還原糖包括兩部分:一是樣品中原有的還原糖、二是蔗糖經酸水解后的還原糖。
2.方法
吸還原糖樣品處理稀釋液50mL→于100ML容量瓶→加→于68-70度水浴上15分→冷卻→加甲基紅2滴→中和→定容→
取此溶液按還原糖的測定方法測定。
2.計算
蔗糖%=F(100/V2-100/V1) /(W╳50/250╳1000)╳ 100╳0.95
式中:F:10ml斐林氏試液相當于轉化糖的質量mg。
V1:測定時消耗未經水解的樣品稀釋體積ml
V2:測定時消耗經過水解的樣品稀釋體積ml
w:原測定還原糖時樣品的重量(G)
1000:將毫升換算成克
0.95:分子的蔗糖經水解后成為2分子的還原糖(一分子的葡萄糖和一分子的果糖)蔗糖的分子量為342,后來成為2×180.則342/360=0.95.所以轉化糖換算到蔗糖應乘以0.95.
四.紙上層析法.
在食品中,糖的組分較為復雜,在淀粉糖漿中含有麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖、麥芽四糖等多種組分.對于這些食品中的各種組分,不可能用化學分析方法進行測定,而用物理分析方法進行測定.
紙層析應用于糖類的分離分析,它利用混合物中各組分物理化學性質的差別,使各組分以不同速度移動而達到分離.
比移值Rf==組分展開的距離/溶劑展開的距離
糖的RF值的規律為:
單糖>雙糖>三糖
戊糖>己糖
酮糖>醛糖
實驗室常用的展開劑:
正丁醇:HAc:H2O==4:1:5
常用的顯色劑:
0.1N AgNO3:NH4OH(SN)=1:1(靈敏度高,但斑點易擴散)
AgNO3/丙酮:NaOH/乙醇=1:1(克服上面缺點)
(顯色劑書上給出許多,同學們可以自己看)
樣品的處理可采用常規法如:糖的提取和蛋白質的除去可看前面講的。
根據Rf值可求出各種糖的Rf與標準樣品的Rf值進行比較,可確定出糖的種類,也可進行定量,用斑點光密度定量法直接在濾紙上測定.用斑點面積校正進行定量。