葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。2005版《中國藥典》一部采用高效液相色譜法測定其葛根素的含量。
一、高效液相色譜法
2005版《中國藥典》葛根含量測定項下:
色譜條件與系統適用性試驗:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-水(25:75)為流動相;檢測波長為250nm。理論板數按葛根素峰計算應不得低于4000。
供試品溶液的制備:取本品粉末約0.1g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入30%乙醇50ml,稱定重量,加熱回流30分鐘,放冷,再稱定重量,用30%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
HPLC法測定葛根及其制劑中葛根素的含量時,使用最多的流動相系統為甲醇-水系統,另外還有甲醇-水,加醋酸調節pH等。
A:以甲醇-水為系統的,常見的比例及實驗條件為:
①Waters2695/ 2996/ Empower 色譜系統;色譜柱Symmetry C18 柱( 3.9mm×150mm, 5μm);流動相:甲醇-水(25:75);DAD檢測波長254nm;柱溫35℃。
②SP8800 型高效液相色譜泵;Hypersil ODS (4.6mm×250mm,5μm大連依利特科學有限公司);流動相:甲醇-水(30:70);柱溫40℃;檢測波長250nm。
③Waters高效液相色譜儀;十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);甲醇-水(40:60)為流動相;檢測波長為250nm;柱溫30℃。
④美國Spectra-Physics 液相色譜儀;色譜柱Lunm C18 (150mm×4.6mm, 5μm ) 不銹鋼柱(美國Phenom enex 公司);流動相為甲醇-水(28:72);檢測波長250nm;柱溫30℃。
B:乙腈-水系統:
①LC-10ATvp高效液相色譜儀;Hypersil ODS 色譜柱(4.6mm×150mm,5μm);乙腈-水(15:85)為流動相;檢測波長250nm。
②TSP 高效液相色譜儀;色譜柱Turner C18H37(5μm,4.6mm×150mm);流動相:乙醇-水(43:207);柱溫30℃;檢測波長250nm。
C:加酸調節的,如:
①LC-10A高效液相色譜儀;色譜柱為ODSC18柱(5μm,4.6mm×150mm);流動相為甲醇-水(35:65),內含0.01%醋酸;柱溫35℃;檢測波長251nm。
②SP-8800高效液相色譜儀;色譜柱ODS-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇-1.4%醋酸溶液( 22:78 );柱溫室溫;測定波長: 250nm。
③美國Beckman公司高效液相色譜儀;Hypersil ODS柱(2.5μm,4.6mm×250mm);流動相為甲醇-氯仿-1.5%冰醋酸(22:1:77);檢測波長250nm。
④SP1000 高效液相色譜泵;色譜柱YMC C18不銹鋼柱(4.6mm×150mm,5μm);流動相:甲醇-水醋酸(42∶100:0.2);檢測波長250nm;柱溫:室溫。
其它如:呂竹芬等測定心血寧滴丸中葛根素的含量,采用高效液相色譜法,Dikma piamonsil C18色譜柱(4.6mm×200mm,5μm),以甲醇-乙腈-水(30:2 :65)為流動相,流速為1.0mL/min,檢測波長250nm。
顏春華等測定腦得生片中葛根素的含量,采用日本島津LC-4A高效液相色譜儀;色譜柱DiamonsilTM (鉆石) C18(200mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈-甲醇-0.1%枸櫞酸溶液(5:25:75);紫外檢測波長250nm;柱溫室溫。
制備樣品溶液時,一般以30%乙醇、50%乙醇、乙醇、甲醇、流動相或鹽酸溶液(9→1000)等為溶劑,采用超聲法提取。
二、其它
楊振林等測定葛根沖劑中葛根素含量,采用薄層- 紫外分光光度法,751GD 型分光光度計(上海分析儀器總廠)。薄層層析硅膠G板,以氯仿-甲醇-水(7:28:0.2)為展開劑,在紫外燈(365nm)下定葛根素位置,刮下斑點,用甲醇洗脫,測定波長為251±1nm。
崔小兵等測定通脈顆粒劑中葛根素及阿魏酸的含量,采用雙波長(λ1= 250nm ,λ2=313nm) 梯度洗脫法。Waters 2690 型高效液相色譜儀;色譜柱Kromasil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);柱溫為30℃,甲醇-1%醋酸水梯度洗脫;檢測波長為250nm;柱溫30℃。
方崇波等采用離子絡合紫外分光光度法測定葛根素及其制劑的含量,采用UV4/2401 紫外分光光度計(島津)。方法::在pH=4.0條件下,葛根素和Al3+形成絡合物,在339.8 nm波長處通過測定吸收度的改變來測定含量。