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血清學(xué)篩選噬菌體

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2012-10-18  來源:丁香通
核心提示: 血清學(xué)篩選噬菌體

1. 準(zhǔn)備 NZY agar plates(至少用前 24 小時(shí)倒好) ,用前在37℃培養(yǎng)箱中烘烤1-2 小時(shí)以去除水滴。
2. 將過夜培養(yǎng)的 XL1-blueMRF' 細(xì)菌 2000 轉(zhuǎn)/ 分,離心10 分鐘,將細(xì)菌溶解在10mMMgSO4 中,調(diào)整細(xì)菌濃度為 OD600=0.5。
3. 融化 NZY top,并將 NZY top 放在 50℃水浴中。
4. 將適量的 XL1-blueMRF' 細(xì)菌溶液與一定稀釋度的 phage 文庫混合,37℃下共同作用 15 分鐘。
① 直徑 90mm 平板:200μl XL1-blue 細(xì)菌+適量的 phage文庫
② 直徑 150mm 平板:600μl XL1-blue 細(xì)菌+適量的 phag 文庫
(噬菌斑數(shù)量一般保持在 3000pfu/90mm;12000pfu/150mm)
5. 將步驟 4 中的混合液與 NZY top 溶液混合(200μl 混合液+3-4mlNZY top 溶液;600μl 混合液+8-10 ml NZY top 溶液) ,倒入到 NZYagar plates中,室溫 下放 10 分鐘左右,然后倒置放于 37℃下培養(yǎng)。
6. 當(dāng)噬菌斑剛好可看到時(shí)(大約 5-8 小時(shí)) ,從培養(yǎng)箱中拿出平板。
7. 將 NC 放入 10mMIPTG溶液中完全浸濕,在空中使膜瀝干,并做好 3 個(gè)不對稱的標(biāo)記。
8. 將 IPTG 處理好的 NC 貼在平板上,不留氣泡,然后倒置放于 37℃下培養(yǎng)。
9. 過夜培養(yǎng)后,第二天早上取出平板,用鑷子將膜輕輕掀起,注意不要將培養(yǎng)基粘在膜上。
10. 將膜放于 50mlTBST 溶液中,水平脫色搖床上震蕩洗膜 3 次,每次10 分鐘。
11. 將膜放入 50ml 封閉液中,水平搖動,封閉 4-6 小時(shí)。
12. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊囊豢梗綋u動處理過夜。
13. 將膜放于 50mlTBST 溶液中,洗膜 3 次,每次 10 分鐘。
14. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊亩梗ǜ鱾(gè)公司的二抗使用滴度不同),室溫水平搖動 1-2 小時(shí)。
15. 將膜放于 50mlTBST 溶液中,洗膜 3 次,每次10 分鐘,最后用 50mlTBS溶液洗膜 15-20 分鐘,取出膜空氣中瀝干。
16. 將膜放入 BCIP-NBT 顯色液中避光顯色,水平搖動直到陽性斑點(diǎn)可見為止。
17. 從顯色液中取出膜放在 TBS溶液中,空氣中使膜干燥。
18. 根據(jù)所做的標(biāo)記,將膜與平板對齊,將平板上對應(yīng)的陽性克隆區(qū)域的培養(yǎng)基挖出放入 500μl SM buffer中,并加入 25 ml chloroform,4℃貯存 (最多可貯6月)。
19. 第一輪篩選得到陽性克隆需要進(jìn)行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如第一輪篩選,只不過用直徑90mm 平板;具體過程見步驟 4, 這時(shí)所加入的噬菌體溶液是第一輪篩選得到的噬菌體上清 (見步18驟),
在用前要滴定好噬菌體的滴度,噬菌斑的數(shù)量以可區(qū)分出單個(gè)克隆,同時(shí)密 度不能太稀為標(biāo)準(zhǔn)(一般 100-200 pfu/90mm) 。
20. 按第一輪相似的過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn),最后顯色,確定真正的陽性克隆,并將陽性單克隆所在的培養(yǎng)基挖出放入 500μl SM buffer 中,并加入 25 ml chloroform,4℃貯存(最多可貯存 6 月) 。
注意:
1. 封閉液一般可用:5%的脫脂牛奶或 1%的 BSA 溶解在 TBST溶液中。
2. 第一輪篩選用 150mm 的平板;第二輪篩選用 90mm 的平板,一般需要篩選 至少 1 x 106 pfu。
3. 認(rèn)真做好三個(gè)不對稱的標(biāo)記,特別在第二輪挑選陽性克隆時(shí)要仔細(xì)將膜與平 板吻合好,不能挑錯(cuò)。
編輯:songjiajie2010

 
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