1. 準備 NZY agar plates（至少用前 24 小時倒好） ，用前在37℃培養箱中烘烤1-2 小時以去除水滴。

2. 將過夜培養的 XL1-blueMRF' 細菌 2000 轉/ 分，離心10 分鐘，將細菌溶解在10mMMgSO4 中，調整細菌濃度為 OD600=0.5。

3. 融化 NZY top，并將 NZY top 放在 50℃水浴中。

4. 將適量的 XL1-blueMRF' 細菌溶液與一定稀釋度的 phage 文庫混合，37℃下共同作用 15 分鐘。

① 直徑 90mm 平板：200μl XL1-blue 細菌+適量的 phage文庫

② 直徑 150mm 平板：600μl XL1-blue 細菌+適量的 phag 文庫

（噬菌斑數量一般保持在 3000pfu/90mm;12000pfu/150mm）

5. 將步驟 4 中的混合液與 NZY top 溶液混合（200μl 混合液+3-4mlNZY top 溶液；600μl 混合液+8-10 ml NZY top 溶液） ，倒入到 NZYagar plates中，室溫 下放 10 分鐘左右，然后倒置放于 37℃下培養。

6. 當噬菌斑剛好可看到時（大約 5-8 小時） ，從培養箱中拿出平板。

7. 將 NC 放入 10mMIPTG溶液中完全浸濕，在空中使膜瀝干，并做好 3 個不對稱的標記。

8. 將 IPTG 處理好的 NC 貼在平板上，不留氣泡，然后倒置放于 37℃下培養。

9. 過夜培養后，第二天早上取出平板，用鑷子將膜輕輕掀起，注意不要將培養基粘在膜上。

10. 將膜放于 50mlTBST 溶液中，水平脫色搖床上震蕩洗膜 3 次，每次10 分鐘。

11. 將膜放入 50ml 封閉液中，水平搖動，封閉 4-6 小時。

12. 在封閉液中加入適當滴度的一抗，水平搖動處理過夜。

13. 將膜放于 50mlTBST 溶液中，洗膜 3 次，每次 10 分鐘。

14. 在封閉液中加入適當滴度的二抗（各個公司的二抗使用滴度不同），室溫水平搖動 1-2 小時。

15. 將膜放于 50mlTBST 溶液中，洗膜 3 次，每次10 分鐘，最后用 50mlTBS溶液洗膜 15-20 分鐘，取出膜空氣中瀝干。

16. 將膜放入 BCIP-NBT 顯色液中避光顯色，水平搖動直到陽性斑點可見為止。

17. 從顯色液中取出膜放在 TBS溶液中，空氣中使膜干燥。

18. 根據所做的標記，將膜與平板對齊，將平板上對應的陽性克隆區域的培養基挖出放入 500μl SM buffer中，并加入 25 ml chloroform，4℃貯存 （最多可貯6月）。

19. 第一輪篩選得到陽性克隆需要進行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如第一輪篩選，只不過用直徑90mm 平板；具體過程見步驟 4， 這時所加入的噬菌體溶液是第一輪篩選得到的噬菌體上清 （見步18驟），

在用前要滴定好噬菌體的滴度，噬菌斑的數量以可區分出單個克隆，同時密 度不能太稀為標準（一般 100-200 pfu/90mm） 。

20. 按第一輪相似的過程進行實驗，最后顯色，確定真正的陽性克隆，并將陽性單克隆所在的培養基挖出放入 500μl SM buffer 中，并加入 25 ml chloroform，4℃貯存（最多可貯存 6 月） 。

注意：

1. 封閉液一般可用：5%的脫脂牛奶或 1%的 BSA 溶解在 TBST溶液中。

2. 第一輪篩選用 150mm 的平板；第二輪篩選用 90mm 的平板，一般需要篩選 至少 1 x 106 pfu。

3. 認真做好三個不對稱的標記，特別在第二輪挑選陽性克隆時要仔細將膜與平 板吻合好，不能挑錯。