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微生物的顯微直接計數法

放大字體  縮小字體 發布日期:2010-05-11
核心提示:一、實驗目的    了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法,掌握顯微鏡下直接計數的技能。二、實驗原理

一、實驗目的

    了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法,掌握顯微鏡下直接計數的技能。

二、實驗原理

    測定微生物細胞數量的方法很多,通常采用的有顯微直接計數法和平板計數法。

    顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液,如有雜菌或雜質,常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板,一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同,只是細菌計數板較薄,可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚,不能使用油鏡,計數板下部的細菌不易看清。

    血球計數板是一塊特制的厚型載片,載片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽分隔成兩半,每個半邊上面各有一個計數區(圖21-1),計數區的刻度有兩種:一種是計數區分為16個大方格(大方格用三線隔開),而每個大方格又分成25個小方格;另一種是一個計數區分成25個大方格(大方格之間用雙線分開),而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造,它們都有一個共同特點,即計數區都由400個小方格組成。

計數區邊長為1mm,則計數區的面積為l mm2,每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋片后,計數區的高度為0.1mm,所以每個計數區的體積為0.1mm3,每個小方格的體積為1/4000mm3

使用血球計數板計數時,先要測定每個小方格中微生物的數量,再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數量。

已知:1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3

所以:1mm3體積應含有小方格數為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格,即系數K=4×106

因此:每ml懸液中含有細胞數= 每個小格中細胞平均數(N)×系數(K)×菌液稀釋倍數d)

三、實驗器材

1.活材料:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面或培養液。

2.器材:顯微鏡、血球計數板、蓋片(22mm×22mm)、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙

四、實驗方法  

1.視待測懸液濃度,加無菌水適當稀釋(斜面一般稀釋到10-2),以每小格的菌數可數為度。

2.取潔凈的血球計數板一塊,在計數區上蓋上一塊蓋片。

3.將酵母菌懸液搖勻,用滴管吸取少許,從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋片的下邊緣摘入一小滴(不宜過多),讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區,勿使氣泡產生,并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上,不要使計數區兩邊平臺沾上懸液,以免加蓋蓋片后,造成計數區深度的升高。然后加蓋蓋片(勿使產生氣泡)。4.靜置片刻,將血球計數板置載物臺上夾穩,先在低鏡下找到計數區后,再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近,觀察時應減弱光照的強度。

5.計數時若計數區是由16個大方格組成,按對角線方位,數左上、左下、右上、右下的4個大方格(即100小格)的菌數。如果是25個大方格組成的計數區,除數上述四個大方格外,還需數中央l大方格的菌數(即80個小格)。如菌體位于大方格的雙線上,計數時則數上線不數下線,數左線不數右線,以減少誤差。

6.對于出芽的酵母菌,芽體達到母細胞大小一半時,即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數2—3次(每次數值不應相差過大,否則應重新操作),求出每一個小格中細胞平均數(N),按公式計算出每ml(g)菌懸液所含酵母菌細胞數量。

7.測數完畢,取下蓋片,用水將血球計數板沖洗干凈,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干,放入盒內保存。

五、實驗作業:   

將實驗結果填入下表中:

 計數次數

每個大方格菌數

稀 釋

倍 數

試管斜面中的總菌數

平均值

1

2

3

4

5

 第一次

 

 

 

 

 

 

 

 

 第二次

 

 

 

 

 

 

 

 

編輯:foodyy

 
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