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第3節 微生物的基因重組

放大字體  縮小字體 發布日期:2005-10-28
基因重組是分子水平上的概念,可以理解成是遺傳物質分子水平上的雜交,雜交必然包含有重組,而重組則不僅限于雜交一種形式。基因重組又稱為遺傳傳遞,是指遺傳物質從一個微生物細胞向另一個微生物細胞傳遞而達到基因的改變,形成新遺傳型個體的過程。它是在細胞繁殖過程或在特定環境中不同細胞接觸,或不接觸,引起遺傳物質傳遞而造成的。在基因重組時,不發生任何堿基對結構上的變化。重組后生物體新的遺傳性狀的出現完全是基因重組的結果。它可以在人為設計的條件下發生,使之服務于人類育種的目的。
 基因重組有原核微生物的接合和F因子轉導,通過雙親細胞的接觸溝通,涉及部分染色體基因的重組;有原核微生物的轉化、轉導,雙親細胞不經接觸,僅涉及個別或少數基因的重組;還有真核微生物的有性雜交、準性生殖,通過雙親細胞的融合,涉及整套染色體基因的重組;此外,原生質體融合是破壁后的原生質體細胞在一定條件下互相融合,實現遺傳物質的重組;而DNA重組技術則是在體外對DNA修飾改變后,設法引入受體細胞再實現基因重組。
3.1.    原核生物的基因重組
原核生物的遺傳物質傳遞的方式有:有轉化、轉導、接合和溶原性轉變等四種方式。
3.1.1.    轉化(transformation)   
轉化是指一個種或品系的生物(受體菌)吸收來自另一個種或品系生物(供體菌)的遺傳物質(DNA片段),通過交換組合把它整和到自己的基因組中去,從而獲得了后者某些遺傳性狀的現象。轉化后的受體菌稱為轉化子,供體菌的DNA片段稱為轉化因子。呈質粒狀態的轉化因子轉化頻率最高。能被轉化的細菌包括革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌,但受體細胞只有在感受態的情況下才能吸收轉化因子。
    感受態是指細胞能從環境中接受轉化因子的這一生理狀態。處于感受態的細菌,其吸收DNA的能力比一般細菌大1000倍。感受態可以產生,也可以消失,它的出現受菌株的遺傳特性、生理狀態(如菌齡等)、培養環境等的影響。例如肺炎雙球菌的感受態出現在對數生長期的中后期,枯草芽孢桿菌等細菌則出現在對數期末和穩定初期。轉化時培養環境中加入環腺苷酸(cAMP)可以使感受態水平提高104倍。
    轉化因子的吸附、吸收和整合:不論是否處于感受態細菌都能吸附DNA,但只有處在感受態的細菌,其吸附的DNA才被吸收。受體細胞吸附的轉化因子,必須是雙鏈的DNA,且DNA分子的相對分子質量不小于3×105 ,但轉化時只有一條鏈進入受體細胞,而另一條鏈被細胞表面的核酸外切酶分解。具體轉化過程如下:先從供體菌提取DNA片段,接著DNA片段與感受態受體菌的細胞表面特定位點結合,在結合位點上,DNA片段中的一條單鏈逐步降解為核苷酸和無機磷酸而解體,另一條鏈逐步進入受體細胞,這是一個消耗能量的過程。進入受體細胞的DNA單鏈與受體菌染色體組上同源區段配對,而受體菌染色體組的相應單鏈片段被切除,并被進入受體細胞的單鏈DNA所取代,隨后修復合成,連接成部分雜合雙鏈。然后受體菌染色體進行復制,其中雜合區段被分離成兩個,一個類似供體菌,一個類似受體菌。當細胞分裂時,此染色體發生分離,形成一個轉化子。
    影響轉化效率的因素:受體細胞的感受態,它決定轉化因子能否被吸收進入受體細胞;受體細胞的限制酶系統和其他核酸酶,它們決定轉化因子在整合前是否被分解;受體和供體染色體的同源性,它決定轉化因子的整合。
在原核微生物中,轉化是一種比較普遍的現象,除肺炎雙球菌外,目前還在
嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈氏桿菌屬、葡萄球菌屬、假單孢桿菌屬、黃單孢桿菌屬等以及若干放線菌和藍細菌中發現具有轉化現象。另外,真核微生物如酵母、粗糙鏈孢霉和黑曲霉中也發現了轉化現象。
3.1.2.    轉導(transduction)
    轉導是以噬菌體為媒介,把一個菌株的遺傳物質導入另一個菌株,并使這個菌株獲得另一個菌株遺傳性狀。轉導又分為普遍性轉導和特異性轉導。
普遍性轉導(generalized transduction)是指轉導型噬菌體能傳遞供體菌株任何基因。如大腸桿菌P1噬菌體、枯草桿菌PBS1噬菌體、傷寒沙門氏菌的P22噬菌體等都能進行普遍性轉導。它的轉導頻率為10-5~10-8。能進行普遍轉導的噬菌體,含有一個使供體菌株染色體斷裂的酶。當噬菌體DNA被噬菌體蛋白外殼包裹時,正常情況下,是將噬菌體本身的DNA包裹進蛋白衣殼內,但也有異常情況出現,供體染色體DNA (通常和噬菌體DNA長度相似)偶然錯誤地被包進噬菌體外殼,而噬菌體本身的DNA卻沒有完全包進去,裝有供體染色體片段的噬菌體稱為轉導顆粒。轉導顆粒可以感染受體菌株,并把供體DNA注入受體細胞內,與受體細胞的DNA進行基因重組,形成部分二倍體。通過重組,供體基因整合到受體細胞的染色體上,從而使受體細胞獲得供體菌的遺傳性狀,產生變異,形成穩定的轉導子,這種轉導稱為完全轉導(如圖5-12)。在普遍性轉導中,有時轉導來的供體DNA不一定都能整合到受體染色體上,產生穩定轉導子,更多的則是轉導來的供體染色體不能整合到受體染色體上,也不能復制,但可以表達,這種轉導稱為流產轉導。
圖5-12.    沙門氏菌的普遍性轉導
在一次轉導中流產轉導往往多于完全轉導的細胞。在流產轉導的情況下,轉導子細胞每分裂一次,轉導來的供體染色體片段只傳給兩個子細胞中的一個。這樣一代一代的分裂下去,供體染色體片段便一直沿著單個細胞單線傳遞下去,稱為單線傳遞(如圖5-13)。  
    特異性轉導(specialized  transduction)是指噬菌體只能轉導供體染色體上某些特定的基因。它的轉導頻率為10-6。特異性轉導是在大腸桿菌K12的溫和型噬菌
圖5-13.    流產轉導中所形成的微小菌落示意圖
細胞中的長線表示染色體,短線表示由轉導噬菌體引入的野生型基因,
         黑點表示酶分子,虛線范圍內是一個菌落中的全部細菌
體(λ)中首次發現的,它只能轉導大腸桿菌染色體上半乳糖發酵基因(ga1)和生物素基因(bio)。當λ噬菌體侵入大腸桿菌K12后,使其溶源化,λ原噬菌體的核酸被整合到大腸桿菌DNA特定位置上,即gal基因和bio基因座位的附近。λ噬菌體可以通過附著位置間一次切離,從細菌染色體上脫落下來,偶而在噬菌體和細菌染色體之間發生不正常交換,誘發產生轉導型噬菌體,帶有細菌染色體基因gal或基因bio(如圖5-14),而噬菌體的部分染色體(大約25%的噬菌體DNA)被留在細菌染色體上,形成帶有ga1基因或bio基因的噬菌體。其中帶有ga1基因的轉導顆粒稱為λdga1,d表示缺陷的意思。這種轉導顆粒不能獨立復制,當它侵染敏感細菌時,不能產生侵染性子代。
    

圖5-14.    轉導噬菌體形成過程

圖5-15.    λdga1+通過lac基因位置的交換所形成的轉導子
         A表示兩次交換產生穩定的轉導子    B表示一次交換產生不穩定的轉導子

    λdga1轉導顆粒導入gal-受體菌后產生兩種情況(如圖5-15),一種是形成穩定的、非溶源性的轉導子,約占1/3。λdga1所帶的ga1+基因通過lac基因位置的兩次交換,永遠取代gal-基因,得到ga1+轉導子;另一種轉導子是不穩定的,約占2/3。它是λdga1轉導顆粒通過lac基因位置的一次交換,使ga1+基因整合到受體染色體的gal-基因旁,這樣受體細胞中除gal-基因外,還有λdga1噬菌體的ga1+基因,其基因型是λdga1+gal-,也稱雜基因子,其后代都能分離出gal-細菌。
3.1.3.    接合(conjugation) 
    接合是通過供體菌和受體菌的直接接觸傳遞遺傳物質。接合有時也稱雜交,接合不僅存在于大腸桿菌中,還存在于其他細菌中,如鼠傷寒沙門氏菌。 
F因子  在細菌中,接合現象研究最清楚的是大腸桿菌。大腸桿菌的接合與其細菌表面的性纖毛有關,大腸桿菌有雄性和雌性之分,而決定它們性別的是F因子的有無。F因子又稱致育因子,能促使兩個細胞之間的接合,是一種質粒。其遺傳組成包括三個部分:原點(是轉移的起點)、致育基因群、配對區域。F因子約有6×104對核苷酸組成,相對分子質量為5×107,  約占大腸桿菌總DNA含量的2%。F因子具有自主地與細菌染色體進行同步復制和轉移到其他細胞中去的能力。它既可以脫離染色體在細胞內獨立存在,也可以整合到染色體基因組上;它既可以通過接合而獲得,也可以通過理化因素的處理而從細胞中消除。
臍狀雌性細菌不含F因子,稱為F—菌株,雄性含有F因子,并且根據F因子在細胞中存在情況的不同而有不同名稱。一種是游離在細胞染色體之外,為自主復制的小環狀DNA分子,這樣的細菌稱為F+菌株;另一種狀態是F因子整合在細菌染色體上,成為細菌染色體的一部分,隨同染色體一起復制,這種細菌稱為Hfr菌株(high frequency recombination),即高頻重組菌株;還有一種狀態是F因子能被整合到細胞核DNA上,也能從上面脫落下來,呈游離存在,但在脫落時,F因子有時能帶一小段細胞核DNA,這種含有游離存在的但又帶有一小段細胞核DNA的F因子的細菌稱為F’菌株。上述三種雄性菌株與雌性菌株接合時,將產生三種不同的結果:
F+×F—  當F+和F—細胞混合在一起時,不同類型的細胞,只要幾分鐘,便成對地連在一起,即所有F+細胞跟F—細胞配好對,同時在細胞間形成一個很細的接合管。F因子穿過接合管,進入F—細胞,使其轉變為F+ 菌株。具體過程為:F+ 菌株的F因子的一條DNA單鏈在特定的位置上發生斷裂,斷裂的單鏈逐漸解開,同時留下另一條環狀單鏈為模板,通過模板的旋轉,一方面解開的一條單鏈通過性纖毛而推入F—菌株中,另一方面,又在供體細胞內,重新組合成一條新的環狀單鏈,以取代解開的單鏈,此即為滾環模型。在F—菌株細胞中,外來的供體DNA單鏈上也合成一條互補的新DNA鏈,并隨之恢復成一條環狀的雙鏈F因子,這樣,F—就變成了F+ 菌株。在F+× F—雜交中,雖然F因子以很高的頻率傳遞,但給體遺產標記的傳遞則是十分稀少的(只有10-6~10-7)。
 F’×F—   F’菌株與F—菌株的接合過程同F+與F—菌株的接合過程,接合后,產生二個F’菌株。
Hfr×F—   當Hfr細菌與 F—細菌混合時,兩細胞接合配對,接著從Hfr細胞把染色體通過接合管定向轉移給F—細胞。Hfr菌株與F—菌株接合的情況比較復雜,接合結果也不完全一樣(圖5-16)。在大多數情況下,受體細菌仍是F—菌株,只有在極少數情況下,由于遺傳物質轉移的完整,受體細胞才能成為Hfr菌株。其原因如下:當Hfr菌株與F—菌株發生接合時,Hfr染色體在F因子處發生斷裂,由環狀變成線狀。緊接著,由于F因子位于線狀染色體之后,處于末端,所以必然要等Hfr的整條染色體全部轉移完后,F因子才能進入到F—細胞。而由于一些因素的影響,在轉移過程中,Hfr染色體常常發生斷裂,因此Hfr菌株的許多基因雖然可以進入F—菌株,越是前端的基因,進入的機會越多,在F—菌株中出現重組子的時間就越早,頻率也高。而對于F因子,其進入F—菌株的機會很少,引起性別變化的可能性也非常小。這樣Hfr與F—菌株接合的結果重組頻率雖高,但卻很少出現F+菌株。 
(1)具有組入F因子(用波狀線表示)的Hfr細胞跟F—細胞配對。雙重圓圈表示構成細菌染色體的雙螺旋DNA。(2)接合管形成,Hfr 染色體從F插入點附近的起始位置(i)開始復制。親本DNA 的一條鏈穿過按合附近的起始位置 (i)開始復制。親本DNA的一條鏈穿過接合管進入受體細胞。(3)在復制和傳遞過程中,正在交配的細菌分開,形成一個F—部分合子或部分雙倍體細胞。在F—細胞中大概還合成了DNA的一條互補鏈。  (4)F—染色體跟從Hfr傳入的染色體片斷發生重組產生穩定的重組型。
3.1.4.    溶原性轉變
 這是一種與轉導相似但又有本質不同的現象。首先是它的溫和型噬菌體不攜帶任何供體菌的基因,其次是這種噬菌體是正常的完整的,而不是異常情況下產生的缺陷型噬菌體。溶原轉變的典型例子是不產毒素的白喉棒狀桿菌(Lorynebactcerium diphthariac),菌株被噬菌體侵染而發生溶原化時,會變成產毒素的致病菌株。其它如沙門氏菌、紅曲霉、鏈霉菌等也具有溶原轉變的能力。


圖5-16.    大腸桿菌的Hfr×F—雜交
3.2.    噬菌體的基因重組
   噬菌體原來指細菌病毒,近年來發現真菌、藻類都有噬菌體。病毒屬于原核生物,是化學成份最簡單的生物,它沒有一般的細胞結構,它的染色體和細菌一樣并不和蛋白質結合在一起。它具有寄生專一性,只能在寄主細胞內繁殖。它可以離開寄主細胞而存活,可是不能繁殖。由于病毒的簡單的體制和它與寄主細胞的特殊關系,它已成為分子遺傳學研究中最普遍采用的材料之一。病毒的研究對認識遺傳物質的本質有著重要的作用,在遺傳工程的研究中它也是一種重要的工具。
 噬菌體就它的化學本質來講,有RNA噬菌體、DNA噬菌體、單鏈噬菌體、雙鏈噬菌體等,就它和寄主的關系來講,可以分為烈性噬菌體和溫和性噬菌體兩大類。
3.2.1.    烈性噬菌體
20世紀40年代在大腸桿菌T2噬菌體中首次發現了噬菌體的基因重組。T2噬菌體有許多突變型,最早發現的有快速溶菌(r)、寄主范圍(h)、小形噬菌斑(m)等突變型。h可以感染野生型細菌和抗T2細菌 (用B/2表示),h+只能感染野生型大腸桿菌B品系;r為快速溶菌突變型,能產生大噬菌斑,r+為遲緩溶菌,生成小的噬菌斑。當h+r(寄主范圍正常,但具速溶性狀)和h r+(無速溶性狀,但寄主范圍擴大)兩種噬菌體同時感染大腸桿菌B品系,然后把子代噬菌體接種在同時長有大腸桿菌B和B/2兩種菌組成的混合菌平板上,結果出現四種不同的噬菌斑(圖5-17)。在四種噬菌斑中,透明而小(hr+)和半透明而大(h+r)是親本組合,半透明而小(h+r+)和透明而大(hr)是重組類型。

圖5-17.    噬菌體h+r-× h-r+產生的四種子裔噬菌體形成的噬菌斑
3.2.2.    溫和性噬菌體
    溫和性噬菌體跟F因子一樣,宛如附加的細菌基因群,既能以自主的自我復制顆粒存在,也可以插入細菌染色體與其一起復制。λ噬菌體是最著名的溫和性噬菌體。
    當λ侵染大腸桿菌時,發生兩種反應:一種是裂解性反應,和烈性噬菌體侵染敏感細菌所進行的反應相同。在寄主體內,侵染的噬菌體DNA立即復制,合成頭部和尾部,裝配成成熟的噬菌體顆粒,裂解寄主細胞,釋放出幾百個成熟的噬菌體。另一種是溶源反應。侵染的噬菌體進入寄主細胞后,其DNA可以整合到寄主細胞染色體上,成為細菌染色體的一部分,以原噬菌體形式存在于細胞中,使細菌溶源化,這種狀態的溫和噬菌體又稱為原噬菌體。受λ噬菌體侵染的大腸桿菌的裂解只是一小部分,其裂解的確切頻率部分依賴于噬菌體和寄主的基因型,部分依賴于侵染的環境條件,其余大部分細菌則進入溶源反應。原噬菌體能夠自發的誘變成成熟的噬菌體顆粒而裂解寄主細胞,紫外線是一種有效的誘發因素。
    
3.3.    真核微生物的基因重組
 真核微生物的基因重組方式有有性雜交、準性生殖和無性生殖等:
3.3.1.    有性雜交
 有性雜交是指在微生物的有性繁殖過程中,兩個性細胞相互接合,通過質配、核配后形成雙倍體的合子,隨之合子進行減數分裂,部分染色體可能發生交換而進行隨機分配,由此而產生重組染色體及新的遺傳型,并把遺傳性狀按一定的規律性遺傳給后代的過程。凡是能產生有性孢子的酵母菌和霉菌,都能進行有性雜交。
 有性雜交在生產實踐中被廣泛用于優良品種的培育。在進行有性雜交時,首先要選擇雜交的親株,不但要考慮到性的親和性,還要考慮其標記,以免在雜種鑒別時引起極大困難;其次,要考慮子囊孢子的形成條件,選用生孢子培養基,營造饑餓條件促進細胞發生減數分裂形成子囊孢子;另外,可以采用群體交配法、孢子雜交法、單倍體細胞交配法等進行有性雜交。群體交配法是將兩種不同交配型的單倍體酵母混合培養在麥芽汁中過夜,當鏡檢時發現有大量的啞鈴型接合細胞時,就可以挑出接種微滴培養液中,培養形成二倍體細胞。孢子雜交法需借助顯微操縱器將不同親株的子囊孢子配對,進行微滴培養和濕室培養,使之發芽接合,形成合子,這種方法的優點在于可以在顯微鏡下直接觀察到合子的形成,但這種方法需精密儀器,費工也大。單倍體細胞交配法與孢子雜交法類似,是用兩種交配型細胞配對放在微滴中培養,在顯微鏡下觀察合子形成,但此法的成功率較小。例如用于酒精發酵的酵母菌和用于面包發酵的酵母菌是同屬一種啤酒酵母(Saccharomyces cereuisiac)的兩個不同菌株,由于各自的特點,它們不能互用。而通過兩者的雜交,得到了產酒率既高,又對麥芽糖及葡萄糖的發酵能力強,產生C02多,生長快,可以用作面包廠和家用發酵酵母的優良菌種。
3.3.2.    準性生殖
 準性生殖是一種類似于有性生殖但比它更原始的一種生殖方式。它可使同一種生物的兩個不同來源的體細胞經融合后,不經過減數分裂和接合的交替,不產生有性孢子和特殊的囊器,僅導致低頻率的基因重組,重組體細胞和一般的營養體細胞沒有什么不同。準性生殖多見于一般不具典型有性生殖的酵母和霉菌,尤其是半知菌中,其主要過程為:
 菌絲聯結  發生聯結的頻率很低,常發生在一些形態上沒有區別的,但在遺傳性狀上有差別的兩個同種親本的體細胞(單倍體)間,。
 形成異核體  當兩個遺傳性狀不同的菌株的菌絲互相接觸時,通過菌絲的聯結,使細胞核由一根菌絲進入另一根菌絲,原有的兩個單倍體核集中到同一個細胞中,形成雙倍的異核體。異核體能獨立生活。
 形成雜合二倍體  異核體的兩個不同遺傳性狀的細胞核融合在一起,產生雜合二倍體。它與異核體不同,與親本也不同,它的DNA含量約為單倍體的二倍,孢子體積約比單倍體孢子大一倍,其它一些性狀也有明顯區別,雜合二倍體相當穩定。核融合后產生雜合二倍體的頻率也是極低的,如構巢曲霉和米曲霉為10-5~10-7。
 體細胞重組和單倍體化  盡管雜合二倍體的無性繁殖很穩定,但也有極少數細胞核在有絲分裂過程中染色體會發生交換和單倍體化,從而形成了極個別的具有新遺傳性狀的單倍體雜合子。如果對雜合二倍體用紫外線、γ射線或氮芥等化學誘變劑進行處理,就會促進染色體斷裂、畸變或導致染色體在兩個子細胞中的分配不均,因而有可能產生有不同性狀組合的單倍體雜合子。
準性生殖為一些沒有有性繁殖過程但有重復生產價值的半知菌及其它微生物的育種,提供了重要的手段。如霉菌中醬油曲霉、黑曲霉等已雜交成功。
 
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