良好的菌種是微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)。在應(yīng)用微生物生產(chǎn)各類食品時，首先是選種的問題，要挑選出符合需要的菌種，一方面可以根據(jù)有關(guān)信息向菌種保藏機構(gòu)、工廠或科研單位直接索取；另一方面根據(jù)所需菌種的形態(tài)、生理、生態(tài)和工藝特點的要求，從自然界特定的生態(tài)環(huán)境中以特定的方法分離出新菌株。其次是育種的工作，根據(jù)菌種的遺傳特點，改良菌株的生產(chǎn)性能，使產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量不斷提高。第三當菌種的性能下降時，還要設(shè)法使它復壯。最后還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合，這樣菌種的優(yōu)良性能才能充分發(fā)揮。
4.1. 自然界工業(yè)菌種篩選程序
我國幅員遼闊，各地氣候條件、土質(zhì)條件、植被條件差異很大，這為自然界中各種微生物的存在提供了良好的生存環(huán)境。自然界中微生物種類繁多，估計不少于幾十萬種，但目前已為人類研究及應(yīng)用的不過千余種。由于微生物到處都有，無孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。而現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)是以純種培養(yǎng)為基礎(chǔ)，故采用各種不同的篩選手段，挑選出性能良好、符合生產(chǎn)需要的純種是工業(yè)育種的關(guān)鍵一步。自然界工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是：采樣、增殖培養(yǎng)、培養(yǎng)分離和篩選。如果產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還需對菌種進行毒性鑒定。
4.1.1. 采樣
以采集土壤為主。一般在有機質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數(shù)量最多，中性偏堿的土壤以細菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，果園、菜園和野果生長區(qū)等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。采樣應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，以溫度適中，雨量不多的秋初為好。因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活數(shù)量較少，暴雨后土壤中微生物會顯著減少。采樣方式是在選好適當?shù)攸c后，用無菌刮鏟、土樣采集器等，采集有代表性的樣品，如特定的土樣類型和土層，葉子碎屑和腐質(zhì)，根系及根系周圍區(qū)域，海底水，泥及沉積物，植物表皮及各部，陰溝污水及污泥，反色動物第一胃內(nèi)含物，發(fā)酵食品等。
具體采集土樣時，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面5~15cm處的土。將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等。采好的樣品應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長。如果要分離嗜冷菌，則在室溫下保存試樣會使嗜冷菌數(shù)量明顯降低。
在采集植物根際土樣時，一般方法是將植物根從土壤中慢慢拔出，浸漬在大量無菌水中約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分土即為根際土樣。
在采集水樣時，將水樣收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，應(yīng)從較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶浸入水中30~50cm處，瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。水樣采集完畢時，應(yīng)迅速從水中取出采集瓶并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶，采集的水樣應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4℃下貯存。
4.1.2. 增殖培養(yǎng)
一般情況下，采來的樣品可以直接進行分離，但是如果樣品中我們所需要的菌類含量并不很多，而另一些微生物卻大量存在。此時，為了容易分離到所需要的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，即設(shè)法增加所要菌種的數(shù)量，以增加分離的幾率。可以通過選擇性的配制培養(yǎng)基（如營養(yǎng)成分、添加抑制劑等），選擇一定的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度等）來控制。具體方法是根據(jù)微生物利用碳源的特點，可選定糖、淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其他微生物就可能死亡或淘汰。對G一菌有選擇的培養(yǎng)基(如結(jié)晶紫營養(yǎng)培養(yǎng)基、紅—紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分離細菌時，培養(yǎng)基中添加濃度一般為50μg／m1的抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長。在分離放線菌時，通常于培養(yǎng)基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、巖石、有機混合腐質(zhì)等的浸出汁) 作為最初分離的促進因子，由此可以分離出更多不同類型的放線菌類型；放線菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和復雜底物(如幾丁質(zhì))，因此，大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進行的，而不是在含豐富營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基上分離的；在放線菌分離瓊脂中通常加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，為了對某些特殊種類的放線菌進行富集和分離，可選擇性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分離真菌時，利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)、分離和簽定；在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素如氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素等即可有效地抑制細菌生長及其菌落形成；抑制細菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，將平皿先干燥3~4天；降低培養(yǎng)基的pH值或在無法降低pH時，加入1：30000玫瑰紅。這樣有利于下階段的純種分離。
4.1.3. 培養(yǎng)分離
通過增殖培養(yǎng)，樣品中的微生物還是處于混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且要控制得細一點，好一點。同時必須進行純種分離，常用的分離方法有稀釋分離法、劃線分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進行適當稀釋，然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，待長出獨立的單個菌落，進行挑選分離。劃線分離法要首先倒培養(yǎng)基平板，然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上劃線。劃線方法可用分步劃線法或一次劃線法，無論用哪種方法，基本原則是確保培養(yǎng)出單個菌落。組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進行表面消毒，用無菌水洗滌數(shù)次后，移植到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天后，可見微生物向組織塊周圍擴展生長。經(jīng)菌落特征和細胞特征觀察確認后，即可由菌落邊緣挑取部分菌種進行移接斜面培養(yǎng)。
對于有些微生物如毛霉、根霉等在分離時，由于其菌絲的蔓延性，極易生長成片，很難挑取單菌落。常在培養(yǎng)基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養(yǎng)基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于單菌落的分離。
4.1.4. 篩選
經(jīng)過分離培養(yǎng)，在平板上出現(xiàn)很多單個菌落，通過菌落形態(tài)觀察，選出所需菌落，然后取菌落的一半進行菌種鑒定，對于符合目的菌特性的菌落，可將之轉(zhuǎn)移到試管斜面純培養(yǎng)。這種從自然界中分離得到的純種稱為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實用價值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。如果此野生型菌株產(chǎn)量偏低，達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，可以留之作為菌種選育的出發(fā)菌株。
4.1.5. 毒性試驗
自然界的一些微生物在一定條件下將產(chǎn)生毒素，為了保證食品的安全性，凡是與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌無須作毒性試驗外，其他微生物均需通過兩年以上的毒性試驗。
4.2. 微生物的誘變育種
從自然界直接分離的菌種，一般而言其發(fā)酵活力往往是比較低的，不能達到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理上的特點，改良菌種。以微生物的自然變異為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的幾率并不高，因為這種變異率太小，僅為10—6~10—10。為了加大其變異率，采用物理和化學因素促進其誘發(fā)突變，這種以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種就是誘變育種，它是國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。 誘變育種具有極其重要的意義，當今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能。誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而且能改進產(chǎn)品的質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝等。從方法上講，它具有方法簡便、工作速度快和效果顯著等優(yōu)點。因此，雖然目前在育種方法上，雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導以及基因工程、原生質(zhì)體融合等方面的研究都在快速地發(fā)展，但誘變育種仍為目前比較主要、廣泛使用的育種手段。
4.2.1. 誘變育種的步驟和方法
誘變育種的步驟如下（圖5－18）：
圖5－18. 誘變育種的步驟
出發(fā)菌株的選擇 用來進行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株。在誘變育種中，出發(fā)菌株的選擇，會直接影響到最后的誘變效果，因此必須對出發(fā)菌株的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當?shù)牧私猓暨x出對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。具體方法是選取自然界新分離的野生型菌株，它們對誘變因素敏感，容易發(fā)生變異；選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株較相象，容易達到較好的誘變效果；選取每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高。另外，出發(fā)菌株還可以同時選取2~3株，在處理比較后，將更適合的菌株留著繼續(xù)誘變。
另外，對于基因重組的出發(fā)菌株，無論是供體還是受體，都必須考慮與重組方式對應(yīng)的基本性能，如感受態(tài)、性親和性、噬菌體吸附位點等，還必須考慮標記互補、選擇性性狀、受菌體的強代謝活性、營養(yǎng)需求、生長速度等，以及與社會公害有關(guān)的問題如耐藥性、致病性、腸道寄生性等。
同步培養(yǎng) 在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細胞，即菌懸液的細胞應(yīng)盡可能達到同步生長狀態(tài)，這稱為同步培養(yǎng)。細菌一般要求培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時群體生長狀態(tài)比較同步，比較容易變異，重復性較好。如亞硝基胍誘變時作用于復制叉處，生長旺盛的細胞中復制叉點較多，堿基類似物也在此時期比較容易進入DNA鏈中。霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。
單細胞(或單孢子) 懸液的制備 這一步的關(guān)鍵是制備一定濃度的分散均勻的單細胞或單孢子懸液，為此要進行細胞的培養(yǎng)，并收集菌體、過濾或離心、洗滌。菌懸液一般可用生理鹽水或緩沖溶液配制，如果是用化學誘變劑處理，因處理時 pH值會變化，必須要用緩沖溶液。除此之外，還應(yīng)注意分散度，方法是先用玻璃珠振蕩分散，再用脫脂棉或濾紙過濾，經(jīng)處理，分散度可達90％以上，這樣，可以保證菌懸液均勻地接觸誘變劑 ，獲得較好誘變效果。最后制得的菌懸液，霉菌孢子或酵母菌細胞的濃度大約為106~107個／ml，放線菌和細菌的濃度大約為108個／ml。菌懸液的細胞可用平板計數(shù)法、血球計數(shù)板或光密度法測定，但以平板計數(shù)法較為準確。
誘變處理 首先選擇合適的誘變劑，然后確定其使用劑量。常用誘變劑有兩大類：物理誘變劑和化學誘變劑。 常用的物理誘變劑有紫外線、x射線、γ射線(如Co60等)、等離子、快中子、α射線、β射線、超聲波等。常用的化學誘變劑有堿基類似物、烷化劑、羥胺、吖定類化合物等。
物理誘變劑中最常用的有紫外線。由于紫外線不需要特殊貴重設(shè)備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)育種。紫外線是波長短于紫色可見光而又緊接紫色光的射線、波長范圍為136～300nm，紫外線波長范圍雖寬，但有效范圍僅限于一個小區(qū)域，多種微生物最敏感的波長集中在265nm處，對應(yīng)于功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當物質(zhì)吸收一定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會激發(fā)，不會產(chǎn)生任何化學變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線，因此它極容易受紫外線的影響而變化。紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結(jié)構(gòu)變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交連，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對于DNA的變化起主要作用。
紫外誘變的方法是：將10m1菌懸液放在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10 min左右。為準確起見，照射前紫外燈應(yīng)先預熱20~30min，然后再進行處理。不同的微生物對于紫外線的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對于誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時間，這樣可以設(shè)計一個照射不同時間梯度的實驗，根據(jù)不同時間照射的死亡率，作出照射時間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當?shù)恼丈鋭┝俊Ｒ话阋哉丈浜笪⑸锏闹滤缆试?0%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來也有傾向于采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時則負突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復少。目前趨向采用低劑量、長時間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。實驗時，為了避免光復活現(xiàn)象，處理過程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養(yǎng)，然后再進行分離篩選。
CO60屬γ射線，是一種高能電磁波，其誘發(fā)的突變率和射線劑量直接有關(guān)，而與時間長短無關(guān)。它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改變DNA結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是導致堿基的化學鍵、脫氧核糖的化學鍵、糖-磷酸相連接的化學鍵的斷裂；間接的效應(yīng)是電離輻射使水和有機分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特別是對嘧啶的作用更強，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。一般照射時多采用菌懸液，也可用長了菌落的平皿直接照射。照射劑量在4~10萬倫琴，或者采用能使微生物產(chǎn)生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。
等離子輸入是一種較新的誘變方法，國外自20世紀60年代中、后期相繼開始把等離子注入技術(shù)應(yīng)用于生物學領(lǐng)域的研究，國內(nèi)將離子束作為一種新技術(shù)應(yīng)用于生物等品種改良的研究則是由中國科學院等離子體物理研究所于1986年開創(chuàng)的。低能離子束是以具質(zhì)量、能量雙重誘變效應(yīng)的特征不同于傳統(tǒng)的電磁輻射，它的注入引發(fā)的生物效應(yīng)，機制相當復雜，既有能量的沉積、動量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導致細胞表面被刻蝕，引起細胞膜透性和膜電場的改良，與γ射線，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時還有質(zhì)量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對生物體的作用可導致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強烈影響生物細胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復突變率低。
化學誘變劑 化學誘變劑的種類很多，根據(jù)它們對DNA的作用機制，可以分為三大類：第一類是烷化劑，它與一個或多個核酸堿基起化學變化，因而引起DNA復制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。例如硫酸二乙酯、亞硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亞硝基胍、亞硝基甲基尿等。第二類是一些堿基類似物，它們通過代謝作用滲入到DNA分子中而引起變異，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鳥嘌呤等。第三類是吖啶類，它造成DNA分子增加或減少一、二個堿基，從而引起堿基突變點以下全部遺傳密碼在轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生錯誤。選擇化學誘變劑時還應(yīng)注意：亞硝胺和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多，其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯被稱為“超誘變劑”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。堿基類似物和羥胺雖然具有很高的特異性，但很少使用，因其回復突變率高，效果不大。
決定化學誘變劑劑量的因素主要有誘變劑的濃度、作用溫度和作用時間。化學誘變劑的處理濃度常用幾微克~幾毫克／毫升，但是這個濃度取決于藥劑、溶劑及微生物本身的特性，還受水解產(chǎn)物的濃度、一些金屬離子以及某些情況下誘變劑的延遲作用的影響。一般對于一種化學誘變劑，處理濃度對不同微生物有一個大致范圍，在進行預試驗時，也通常是將處理濃度、處理溫度確定后，測定不同時間的致死率來確定適宜的誘變劑量。這里需要說明的是化學誘變劑與物理誘變劑不同，在處理到確定時間后，要有合適的終止反應(yīng)方法，一般采用稀釋法、解毒劑或改變pH值等方法來終止反應(yīng)。
要確定一個合適的劑量，通常要經(jīng)過多次試驗，就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達到一定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率下降。根據(jù)對紫外線、x 射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中。而負突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。
在誘變育種時，有時可根據(jù)實際情況，采用多種誘變劑復合處理的辦法。復合處理方法主要有三類：第一類是兩種或多種誘變劑先后使用；第二類是同一種誘變劑的重復使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。如果能使用不同作用機制的誘變劑來做復合處理，可能會取得更好的誘變效果。誘變劑的復合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對誘變育種的工作是很有價值的。
中間培養(yǎng) 對于剛經(jīng)誘變劑處理過的菌株，有一個表現(xiàn)遲滯的過程，即細胞內(nèi)原酶有量的稀釋過程（生理延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。據(jù)此應(yīng)讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，使細胞的遺傳物質(zhì)復制，繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，穩(wěn)定的變異就會顯現(xiàn)出來。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。
分離和篩選 經(jīng)過中間培養(yǎng)，分離出大量的較純的單個菌落，接著，要從幾千萬個菌落中篩選出幾個好的，即篩選出所謂性能良好的正突變菌株，這將要花費大量的人力和物力。怎樣設(shè)計才能花費較少的工作量達到最好的效果，這是篩選工作中的一條原則。一般采用一些方法加以簡化，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應(yīng)直接挑取高產(chǎn)變異菌株等。平皿反應(yīng)是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應(yīng)，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應(yīng)的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標志。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。
4.2.2. 營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用
在誘變育種工作中，營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用有著十分重要的意義。營養(yǎng)缺陷型菌株是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿基等)的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)才能正常生長繁殖的變異菌株。其變異前的菌株稱為野生菌株。凡是能滿足野生菌株正常生長的最低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酵母膏等，能滿足各種營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基(CM)；在基本培養(yǎng)基中只是有針對性的加入某一種或某幾種自身不能合成的有機營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長的培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)基(SM)。
營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。誘變劑處理時與其它誘變處理基本相同。在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之幾至千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。抗生素法是利用野生型菌株能在MM中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于“休眠狀態(tài)”，這時，加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。在選擇抗生素時，細菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 菌絲過濾法只適用于絲狀真菌，其原理是在基本培養(yǎng)基中，野生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再進行過濾。如此重復數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，同樣達到“濃縮”營養(yǎng)缺陷型的目的。
營養(yǎng)缺陷型的檢出方法很多，主要有影印法、夾層法、逐個檢出法、限量補充培養(yǎng)法等四種。影印法是將誘變處理后的細胞涂布在完全培養(yǎng)基表面上，經(jīng)培養(yǎng)后長出菌落，然后用一小塊直徑比平皿稍小的圓柱形木塊復蓋于滅過菌的絲絨布上作為接種工具，將長出菌落的平皿倒轉(zhuǎn)過來，在絲絨上輕輕按一下，轉(zhuǎn)接到另一基本培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，比較這兩個平皿長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)前一平扳上某一部位長有菌落，而在后一培養(yǎng)基上的相應(yīng)部位卻沒有，就說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌落。夾層培養(yǎng)法是先在培養(yǎng)皿上倒一層基本培養(yǎng)基，冷凝后加上一層含菌液的基本培養(yǎng)基，凝固后再澆上一薄層的基本培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)后，在皿底對首先出現(xiàn)的菌落做標記，然后再倒上一薄層完全培養(yǎng)基(或補充培養(yǎng)基)，再培養(yǎng)，這時再出現(xiàn)的新菌落，多數(shù)即為營養(yǎng)缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。逐個檢出法是將經(jīng)過誘變處理的細胞涂布在完全培養(yǎng)基平板上，待長出單個菌落后，用接種針或牙簽將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基上卻不長菌落，說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌株。限量補充培養(yǎng)法是將誘變處理后的細胞接種在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培養(yǎng)基上。野生型菌株就會迅速生長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型菌株只能形成生長緩慢的微小菌落，因而可以識別檢出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，則可直接在基本培養(yǎng)基上加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。
確定生長譜是指采用上法選出的缺陷型菌株經(jīng)幾次驗證確定后，還需確定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，還是維生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生長譜測定可以用兩種方法：一種是將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，洗滌培養(yǎng)基，制備成細胞懸液后，與MM培養(yǎng)基（融化并涼至50°C）混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5~6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組織營養(yǎng)物的濾紙圓片，培養(yǎng)后會在組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。另一種方法是以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50°C的MM培養(yǎng)基鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在什么組合長出可推知其營養(yǎng)因子。
營養(yǎng)缺陷型菌株不論在科學實驗中，還是在生產(chǎn)實踐中都具有廣泛的用途。利用營養(yǎng)缺陷型菌株定量分析各種生長因素的方法稱為微生物分析法。常用于分析食品中氨基酸和維生素的含量，因為在一定濃度范圍內(nèi)，營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的數(shù)量與其所需維生素和氨基酸的量成正比。這種方法特異性強，靈敏度高，所用樣品可以很少而且不需提純，也不需要復雜的儀器設(shè)備。 利用營養(yǎng)缺陷型菌株作為研究轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合等遺傳規(guī)律的標記菌種和微生物雜交育種的標記。由于微生物經(jīng)雜交育種后形成的雜種在形態(tài)上往往與親本難以區(qū)別，因此常常選擇不同的營養(yǎng)缺陷型來進行標記，通過測定后代的營養(yǎng)特性，以判斷它們雜交的性質(zhì)。利用營養(yǎng)缺陷型菌株測定微生物的代謝途徑，并通過有意識地控制代謝途徑，獲得更多的我們所需要的代謝產(chǎn)物，從而成為發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、核苷酸和各種維生素等的生產(chǎn)菌種，例如利用絲氨酸營養(yǎng)缺陷型可以生產(chǎn)更多的賴氨酸，利用腺苷酸營養(yǎng)缺陷型菌株可提高肌苷酸的產(chǎn)量等。
4.3. 微生物的雜交育種
雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)細胞的互相聯(lián)結(jié)、細胞核融合，隨后細胞核進行減數(shù)分裂，遺傳性狀會出現(xiàn)分離和重新組合的現(xiàn)象，產(chǎn)生具有各種新性狀的重組體，然后經(jīng)分離和篩選，獲得符合要求的生產(chǎn)菌株。盡管一些優(yōu)良菌種的選育主要是采用誘變育種的方法，但是某一菌株長期使用誘變劑處理后，其生活能力一般要逐漸下降，如生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢、產(chǎn)量增加緩慢、誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，常采用雜交育種的方法繼續(xù)優(yōu)化菌株。另外，由于雜交育種是選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，因此不論在方向性還是自覺性方面，都比誘變育種前進了一大步，所以它是微生物菌種選育的另一重要途徑。但由于雜交育種的方法復雜，工作進度慢，因此還很難象誘變育種那樣得到普遍的推廣和應(yīng)用。
4.3.1. 細菌的雜交
細菌的雜交行為是于1946年首次在大腸桿菌K-12菌株中發(fā)現(xiàn)并證實的。首先在大腸桿菌K-12菌株中誘發(fā)一個營養(yǎng)缺陷型(A—)、不能發(fā)酵乳糖(Lac—)和抗鏈霉素(SM r )以及對噬菌體T l敏感的突變體，可以寫成A—B +Lac—SM r T s1；另一菌株誘發(fā)成一個營養(yǎng)缺陷型(B—)，能發(fā)酵乳糖(Lac+)，對鏈霉菌敏感(SM s)和抗噬菌體T l的突變體A+B—Lac +SM s T r 1。這兩個菌株各自都不能在基本培養(yǎng)基上生長，如果把大約105 /ml濃度的上述兩種菌株混合在一起，并接種在基本培養(yǎng)基上，則能長出少數(shù)菌落；如果把上述兩種菌株分別接種到一個特制的U型管的兩端去培養(yǎng),中間用一片可以使培養(yǎng)液流通,但不能使細菌通過的燒結(jié)玻璃隔開,那么在基本培養(yǎng)基上就不會出現(xiàn)菌落。這說明細胞的接觸是導致基因重組的必要條件，即細菌通過接合完成了雜交行為。在鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、肺炎克氏桿菌、霍亂弧菌等許多細菌中也發(fā)現(xiàn)了沒接合現(xiàn)象，但是至今未在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)接合現(xiàn)象。細菌的雜交還可以通過F因子轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導等發(fā)生基因重組,但通過這些方式進行雜交育種獲得成功的報道還不多。
4.3.2. 放線菌的雜交育種
放線菌的基因重組于1955年至1957年首先在天藍鏈霉菌中發(fā)現(xiàn),以后在其它科、屬、種中相繼發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)在常用的放線菌雜交方法主要有三種,即混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法。國外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素產(chǎn)生菌的雜交育種方面都有過成功的報道,在我國幾乎與國外同時起步開展放線菌基因重組的研究工作,并取得了一定成效。
4.3.3. 酵母的雜交育種
一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細胞經(jīng)誘導雜交而形成二倍體細胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法，群體交配法，單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運用罕見交配法更易獲得結(jié)果。
4.3.4. 霉菌的雜交育種
霉菌的雜交育種主要是通過體細胞的核融合和基因重組，即通過準性生殖過程而不是通過性細胞的融合。
霉菌的雜交育種的步驟為：第一 選擇直接親本。用來進行雜交的兩個野生型菌株叫原始親本。原始親本經(jīng)過誘變以后得到各種突變型菌株,假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本,就叫直接親本。作為直接親本的遺傳標記有多種，如營養(yǎng)突變型、抗藥突變型、形態(tài)突變型等,目前應(yīng)用普遍的是營養(yǎng)缺陷型菌株。第二是異核體的形成。在基本培養(yǎng)基上,強迫兩株營養(yǎng)缺陷型互補營養(yǎng)，則這兩個菌株經(jīng)過菌絲細胞間的吻合形成異核體。由直接親本形成異核體的方法有：完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法、完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法、液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法、有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法、基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法、基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。第三是雙倍體的檢出，檢出雙倍體的方法有很多種，如用放大鏡觀察異核體菌落表面，如果發(fā)現(xiàn)有野生型顏色的斑點和扇面，即可用接種針將其孢子挑出，進行分離純化，即得雜合雙倍體。或者將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。第四是分離子的檢出。可以用選擇性培養(yǎng)基篩選分離子，也可以將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色（隱性標記）的斑點或扇面出現(xiàn)，從每個菌落接出一個斑點或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。
4.4. 原生質(zhì)體育種
原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)體融合育種是基因重組的一種重要方法，由于它具有一系列的特點，所以目前已為國內(nèi)外微生物育種學者所廣泛研究和應(yīng)用。
由于細胞壁是微生物細胞之間進行物質(zhì)交換的主要障礙之一，用一些方法將細胞壁去除后在高滲條件下形成類似球形的原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體融合時又加入融合促進劑聚乙二醇（PEG）和Ca++，所以微生物原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交法，霉菌與放線菌已達10—l ~10—2，細菌與酵母已達10-5~10-6。原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。已報道的絲狀真菌種間的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬；屬間原生質(zhì)體融合主要在酵母中實現(xiàn)：熱帶假絲酸母×飾針復膜孢酵母，釀酒酵母×彭貝裂殖酵母等。原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程，因此可以想象遺傳物質(zhì)的交換更為完整，提高菌株產(chǎn)量的潛力更大。原生質(zhì)體融合可以是兩株以上的親株同時參與融合，如研究表明兩個親株的融合頻率為2.8×10-2，三個親株的融合頻率為4×10-4，四個親株的融合頻率為4.9×10-7。
原生質(zhì)體融合育種的步驟是：標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證 ，原生質(zhì)體制備，等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合，涂布于再生培養(yǎng)基、再生出菌落，選擇性培養(yǎng)基上劃線生長、分離驗證、挑取融合子進一步試驗保藏，生產(chǎn)性能篩選。
前面已經(jīng)提到轉(zhuǎn)化在工業(yè)微生物遺傳改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少數(shù)細菌外，多數(shù)微生物的自然轉(zhuǎn)化能力很低，特別是真核微生物幾乎很少能發(fā)現(xiàn)自然轉(zhuǎn)化。這主要是因為轉(zhuǎn)化的必備條件之一是感受態(tài)的存在，經(jīng)過人工誘導法可使一些微生物獲得感受態(tài)，已成功的例子如枯草芽抱桿菌、大腸桿菌等并得到廣泛應(yīng)用。但在鏈霉菌及真菌中，人工誘導法實現(xiàn)完整細胞的轉(zhuǎn)化的成功例子就不多了。原生質(zhì)體技術(shù)出現(xiàn)后不久，Bibb等發(fā)現(xiàn)，當有PEG存在時，質(zhì)粒DNA可以很高頻率轉(zhuǎn)化鏈霉菌原生質(zhì)體，從而徹底擺脫了轉(zhuǎn)化依賴感受態(tài)出現(xiàn)的限制。在真菌中巳成功地進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的菌株如釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉等。
圖5－19. 基因工程技術(shù)的主要操作步驟示意圖
4.5. 基因工程技術(shù)用于工業(yè)菌種改良
基因工程技術(shù)又稱基因操作、基因克隆、DNA重組等，是一個將含目的基因DNA片段經(jīng)體外操作與載體連接，轉(zhuǎn)入一個受體細胞并使之擴增、表達的過程。因此比其它育種方法更有目的性和方向性，效率更高。其全部過程大體可分為以下6個步驟（如圖5－19）：目的基因的獲得；載體的選擇；含目的基因的DNA片段克隆入載體中構(gòu)成重組載體；將重組載體引入宿主細胞內(nèi)進行復制、擴增；篩選出帶有重組目的基因的轉(zhuǎn)化細胞；鑒定外源基因的表達產(chǎn)物。
目的基因的獲得 目的基因的獲得一般有四條途徑；從生物細胞中提取、純化染色體DNA并經(jīng)適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶部分酶切；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA在體外合成互補DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及動，植物細胞中特定基因的克隆；化學合成，主要用于那些結(jié)構(gòu)簡單、核苷酸順序清楚的基因的克隆；從基因庫中篩選、擴增獲得，目前認為是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。
載體的選擇 基因工程中所用的載體系統(tǒng)主要有細菌質(zhì)粒、粘性質(zhì)粒、酵母菌質(zhì)粒、λ噬菌體、動物病毒等。載體一般為環(huán)狀DNA，能在體外經(jīng)限制酶及DNA連接酶的作用同目的基因結(jié)合成環(huán)狀DNA (即重組DNA)，然后經(jīng)轉(zhuǎn)化進入受體細胞大量復制和表達。
重組栽體的構(gòu)建 DNA體外重組是將目的基因用DNA連接酶連接到合適的載體DNA上，可采用粘端連接法和末端連接法。
工程菌的獲得 經(jīng)重組DNA的轉(zhuǎn)化與鑒定，得到符合原定的“設(shè)計藍圖”的工程菌。
4.1. 自然界工業(yè)菌種篩選程序
我國幅員遼闊，各地氣候條件、土質(zhì)條件、植被條件差異很大，這為自然界中各種微生物的存在提供了良好的生存環(huán)境。自然界中微生物種類繁多，估計不少于幾十萬種，但目前已為人類研究及應(yīng)用的不過千余種。由于微生物到處都有，無孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。而現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)是以純種培養(yǎng)為基礎(chǔ)，故采用各種不同的篩選手段，挑選出性能良好、符合生產(chǎn)需要的純種是工業(yè)育種的關(guān)鍵一步。自然界工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是：采樣、增殖培養(yǎng)、培養(yǎng)分離和篩選。如果產(chǎn)物與食品制造有關(guān)，還需對菌種進行毒性鑒定。
4.1.1. 采樣
以采集土壤為主。一般在有機質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數(shù)量最多，中性偏堿的土壤以細菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，果園、菜園和野果生長區(qū)等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。采樣應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，以溫度適中，雨量不多的秋初為好。因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活數(shù)量較少，暴雨后土壤中微生物會顯著減少。采樣方式是在選好適當?shù)攸c后，用無菌刮鏟、土樣采集器等，采集有代表性的樣品，如特定的土樣類型和土層，葉子碎屑和腐質(zhì)，根系及根系周圍區(qū)域，海底水，泥及沉積物，植物表皮及各部，陰溝污水及污泥，反色動物第一胃內(nèi)含物，發(fā)酵食品等。
具體采集土樣時，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面5~15cm處的土。將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的樣必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等。采好的樣品應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4℃下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長。如果要分離嗜冷菌，則在室溫下保存試樣會使嗜冷菌數(shù)量明顯降低。
在采集植物根際土樣時，一般方法是將植物根從土壤中慢慢拔出，浸漬在大量無菌水中約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分土即為根際土樣。
在采集水樣時，將水樣收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。由于表層水中含有泥沙，應(yīng)從較深的靜水層中采集水樣。方法是：握住采樣瓶浸入水中30~50cm處，瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。水樣采集完畢時，應(yīng)迅速從水中取出采集瓶并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶，采集的水樣應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4℃下貯存。
4.1.2. 增殖培養(yǎng)
一般情況下，采來的樣品可以直接進行分離，但是如果樣品中我們所需要的菌類含量并不很多，而另一些微生物卻大量存在。此時，為了容易分離到所需要的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，即設(shè)法增加所要菌種的數(shù)量，以增加分離的幾率。可以通過選擇性的配制培養(yǎng)基（如營養(yǎng)成分、添加抑制劑等），選擇一定的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度等）來控制。具體方法是根據(jù)微生物利用碳源的特點，可選定糖、淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其他微生物就可能死亡或淘汰。對G一菌有選擇的培養(yǎng)基(如結(jié)晶紫營養(yǎng)培養(yǎng)基、紅—紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分離細菌時，培養(yǎng)基中添加濃度一般為50μg／m1的抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長。在分離放線菌時，通常于培養(yǎng)基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、巖石、有機混合腐質(zhì)等的浸出汁) 作為最初分離的促進因子，由此可以分離出更多不同類型的放線菌類型；放線菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和復雜底物(如幾丁質(zhì))，因此，大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復雜底物的瓊脂平板上進行的，而不是在含豐富營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基上分離的；在放線菌分離瓊脂中通常加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，為了對某些特殊種類的放線菌進行富集和分離，可選擇性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分離真菌時，利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)、分離和簽定；在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素如氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素等即可有效地抑制細菌生長及其菌落形成；抑制細菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，將平皿先干燥3~4天；降低培養(yǎng)基的pH值或在無法降低pH時，加入1：30000玫瑰紅。這樣有利于下階段的純種分離。
4.1.3. 培養(yǎng)分離
通過增殖培養(yǎng)，樣品中的微生物還是處于混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且要控制得細一點，好一點。同時必須進行純種分離，常用的分離方法有稀釋分離法、劃線分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進行適當稀釋，然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，待長出獨立的單個菌落，進行挑選分離。劃線分離法要首先倒培養(yǎng)基平板，然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上劃線。劃線方法可用分步劃線法或一次劃線法，無論用哪種方法，基本原則是確保培養(yǎng)出單個菌落。組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進行表面消毒，用無菌水洗滌數(shù)次后，移植到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天后，可見微生物向組織塊周圍擴展生長。經(jīng)菌落特征和細胞特征觀察確認后，即可由菌落邊緣挑取部分菌種進行移接斜面培養(yǎng)。
對于有些微生物如毛霉、根霉等在分離時，由于其菌絲的蔓延性，極易生長成片，很難挑取單菌落。常在培養(yǎng)基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養(yǎng)基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于單菌落的分離。
4.1.4. 篩選
經(jīng)過分離培養(yǎng)，在平板上出現(xiàn)很多單個菌落，通過菌落形態(tài)觀察，選出所需菌落，然后取菌落的一半進行菌種鑒定，對于符合目的菌特性的菌落，可將之轉(zhuǎn)移到試管斜面純培養(yǎng)。這種從自然界中分離得到的純種稱為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實用價值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。如果此野生型菌株產(chǎn)量偏低，達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，可以留之作為菌種選育的出發(fā)菌株。
4.1.5. 毒性試驗
自然界的一些微生物在一定條件下將產(chǎn)生毒素，為了保證食品的安全性，凡是與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌無須作毒性試驗外，其他微生物均需通過兩年以上的毒性試驗。
4.2. 微生物的誘變育種
從自然界直接分離的菌種，一般而言其發(fā)酵活力往往是比較低的，不能達到工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此要根據(jù)菌種的形態(tài)、生理上的特點，改良菌種。以微生物的自然變異為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的幾率并不高，因為這種變異率太小，僅為10—6~10—10。為了加大其變異率，采用物理和化學因素促進其誘發(fā)突變，這種以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種就是誘變育種，它是國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。 誘變育種具有極其重要的意義，當今發(fā)酵工業(yè)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能。誘變育種不僅能提高菌種的生產(chǎn)性能而且能改進產(chǎn)品的質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝等。從方法上講，它具有方法簡便、工作速度快和效果顯著等優(yōu)點。因此，雖然目前在育種方法上，雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導以及基因工程、原生質(zhì)體融合等方面的研究都在快速地發(fā)展，但誘變育種仍為目前比較主要、廣泛使用的育種手段。
4.2.1. 誘變育種的步驟和方法
誘變育種的步驟如下（圖5－18）：
圖5－18. 誘變育種的步驟
出發(fā)菌株的選擇 用來進行誘變或基因重組育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株。在誘變育種中，出發(fā)菌株的選擇，會直接影響到最后的誘變效果，因此必須對出發(fā)菌株的產(chǎn)量、形態(tài)、生理等方面有相當?shù)牧私猓暨x出對誘變劑敏感性大、變異幅度廣、產(chǎn)量高的出發(fā)菌株。具體方法是選取自然界新分離的野生型菌株，它們對誘變因素敏感，容易發(fā)生變異；選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株較相象，容易達到較好的誘變效果；選取每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變可能效果迭加，積累更多的提高。另外，出發(fā)菌株還可以同時選取2~3株，在處理比較后，將更適合的菌株留著繼續(xù)誘變。
另外，對于基因重組的出發(fā)菌株，無論是供體還是受體，都必須考慮與重組方式對應(yīng)的基本性能，如感受態(tài)、性親和性、噬菌體吸附位點等，還必須考慮標記互補、選擇性性狀、受菌體的強代謝活性、營養(yǎng)需求、生長速度等，以及與社會公害有關(guān)的問題如耐藥性、致病性、腸道寄生性等。
同步培養(yǎng) 在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細胞，即菌懸液的細胞應(yīng)盡可能達到同步生長狀態(tài)，這稱為同步培養(yǎng)。細菌一般要求培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時群體生長狀態(tài)比較同步，比較容易變異，重復性較好。如亞硝基胍誘變時作用于復制叉處，生長旺盛的細胞中復制叉點較多，堿基類似物也在此時期比較容易進入DNA鏈中。霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。
單細胞(或單孢子) 懸液的制備 這一步的關(guān)鍵是制備一定濃度的分散均勻的單細胞或單孢子懸液，為此要進行細胞的培養(yǎng)，并收集菌體、過濾或離心、洗滌。菌懸液一般可用生理鹽水或緩沖溶液配制，如果是用化學誘變劑處理，因處理時 pH值會變化，必須要用緩沖溶液。除此之外，還應(yīng)注意分散度，方法是先用玻璃珠振蕩分散，再用脫脂棉或濾紙過濾，經(jīng)處理，分散度可達90％以上，這樣，可以保證菌懸液均勻地接觸誘變劑 ，獲得較好誘變效果。最后制得的菌懸液，霉菌孢子或酵母菌細胞的濃度大約為106~107個／ml，放線菌和細菌的濃度大約為108個／ml。菌懸液的細胞可用平板計數(shù)法、血球計數(shù)板或光密度法測定，但以平板計數(shù)法較為準確。
誘變處理 首先選擇合適的誘變劑，然后確定其使用劑量。常用誘變劑有兩大類：物理誘變劑和化學誘變劑。 常用的物理誘變劑有紫外線、x射線、γ射線(如Co60等)、等離子、快中子、α射線、β射線、超聲波等。常用的化學誘變劑有堿基類似物、烷化劑、羥胺、吖定類化合物等。
物理誘變劑中最常用的有紫外線。由于紫外線不需要特殊貴重設(shè)備，只要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著，因此被廣泛應(yīng)用于工業(yè)育種。紫外線是波長短于紫色可見光而又緊接紫色光的射線、波長范圍為136～300nm，紫外線波長范圍雖寬，但有效范圍僅限于一個小區(qū)域，多種微生物最敏感的波長集中在265nm處，對應(yīng)于功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當物質(zhì)吸收一定能量的紫外線后，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發(fā)而造成突變；而不吸收紫外線的物質(zhì)，能量不發(fā)生轉(zhuǎn)移，分子也不會激發(fā)，不會產(chǎn)生任何化學變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線，因此它極容易受紫外線的影響而變化。紫外線的誘變作用是由于它引起DNA分子結(jié)構(gòu)變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內(nèi)和分子間的交連，核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產(chǎn)生等，特別是嘧啶二聚體的產(chǎn)生對于DNA的變化起主要作用。
紫外誘變的方法是：將10m1菌懸液放在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，液層厚度約為2mm，啟動磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時間以幾秒至數(shù)十分鐘為宜，具芽孢的菌株需處理10 min左右。為準確起見，照射前紫外燈應(yīng)先預熱20~30min，然后再進行處理。不同的微生物對于紫外線的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對于誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的只有照射時間，這樣可以設(shè)計一個照射不同時間梯度的實驗，根據(jù)不同時間照射的死亡率，作出照射時間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當?shù)恼丈鋭┝俊Ｒ话阋哉丈浜笪⑸锏闹滤缆试?0%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來也有傾向于采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認為，偏低的劑量處理后正突變率較高，而用較高的劑量時則負突變率較高，但高劑量造成損傷大、回復少。目前趨向采用低劑量、長時間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。實驗時，為了避免光復活現(xiàn)象，處理過程應(yīng)在暗室的紅光下操作，處理完畢后，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養(yǎng)，然后再進行分離篩選。
CO60屬γ射線，是一種高能電磁波，其誘發(fā)的突變率和射線劑量直接有關(guān)，而與時間長短無關(guān)。它能產(chǎn)生電離作用，直接和間接改變DNA結(jié)構(gòu)。直接的效應(yīng)是導致堿基的化學鍵、脫氧核糖的化學鍵、糖-磷酸相連接的化學鍵的斷裂；間接的效應(yīng)是電離輻射使水和有機分子產(chǎn)生自由基，自由基作用于DNA分子，特別是對嘧啶的作用更強，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。一般照射時多采用菌懸液，也可用長了菌落的平皿直接照射。照射劑量在4~10萬倫琴，或者采用能使微生物產(chǎn)生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。
等離子輸入是一種較新的誘變方法，國外自20世紀60年代中、后期相繼開始把等離子注入技術(shù)應(yīng)用于生物學領(lǐng)域的研究，國內(nèi)將離子束作為一種新技術(shù)應(yīng)用于生物等品種改良的研究則是由中國科學院等離子體物理研究所于1986年開創(chuàng)的。低能離子束是以具質(zhì)量、能量雙重誘變效應(yīng)的特征不同于傳統(tǒng)的電磁輻射，它的注入引發(fā)的生物效應(yīng)，機制相當復雜，既有能量的沉積、動量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導致細胞表面被刻蝕，引起細胞膜透性和膜電場的改良，與γ射線，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發(fā)生一系列碰撞，生物大分子獲得能量時，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時還有質(zhì)量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強的電離作用，還能產(chǎn)生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對生物體的作用可導致較高的突變率；另外由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過這種電、能、質(zhì)的聯(lián)合作用，將強烈影響生物細胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩(wěn)定，回復突變率低。
化學誘變劑 化學誘變劑的種類很多，根據(jù)它們對DNA的作用機制，可以分為三大類：第一類是烷化劑，它與一個或多個核酸堿基起化學變化，因而引起DNA復制時堿基配對的轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。例如硫酸二乙酯、亞硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亞硝基胍、亞硝基甲基尿等。第二類是一些堿基類似物，它們通過代謝作用滲入到DNA分子中而引起變異，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鳥嘌呤等。第三類是吖啶類，它造成DNA分子增加或減少一、二個堿基，從而引起堿基突變點以下全部遺傳密碼在轉(zhuǎn)錄和翻譯時產(chǎn)生錯誤。選擇化學誘變劑時還應(yīng)注意：亞硝胺和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多，其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯被稱為“超誘變劑”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。堿基類似物和羥胺雖然具有很高的特異性，但很少使用，因其回復突變率高，效果不大。
決定化學誘變劑劑量的因素主要有誘變劑的濃度、作用溫度和作用時間。化學誘變劑的處理濃度常用幾微克~幾毫克／毫升，但是這個濃度取決于藥劑、溶劑及微生物本身的特性，還受水解產(chǎn)物的濃度、一些金屬離子以及某些情況下誘變劑的延遲作用的影響。一般對于一種化學誘變劑，處理濃度對不同微生物有一個大致范圍，在進行預試驗時，也通常是將處理濃度、處理溫度確定后，測定不同時間的致死率來確定適宜的誘變劑量。這里需要說明的是化學誘變劑與物理誘變劑不同，在處理到確定時間后，要有合適的終止反應(yīng)方法，一般采用稀釋法、解毒劑或改變pH值等方法來終止反應(yīng)。
要確定一個合適的劑量，通常要經(jīng)過多次試驗，就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達到一定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率下降。根據(jù)對紫外線、x 射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中。而負突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。
在誘變育種時，有時可根據(jù)實際情況，采用多種誘變劑復合處理的辦法。復合處理方法主要有三類：第一類是兩種或多種誘變劑先后使用；第二類是同一種誘變劑的重復使用；第三類是兩種或多種誘變劑的同時使用。如果能使用不同作用機制的誘變劑來做復合處理，可能會取得更好的誘變效果。誘變劑的復合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對誘變育種的工作是很有價值的。
中間培養(yǎng) 對于剛經(jīng)誘變劑處理過的菌株，有一個表現(xiàn)遲滯的過程，即細胞內(nèi)原酶有量的稀釋過程（生理延遲），需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。據(jù)此應(yīng)讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，使細胞的遺傳物質(zhì)復制，繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，穩(wěn)定的變異就會顯現(xiàn)出來。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。
分離和篩選 經(jīng)過中間培養(yǎng)，分離出大量的較純的單個菌落，接著，要從幾千萬個菌落中篩選出幾個好的，即篩選出所謂性能良好的正突變菌株，這將要花費大量的人力和物力。怎樣設(shè)計才能花費較少的工作量達到最好的效果，這是篩選工作中的一條原則。一般采用一些方法加以簡化，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應(yīng)直接挑取高產(chǎn)變異菌株等。平皿反應(yīng)是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應(yīng)，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應(yīng)的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標志。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。
4.2.2. 營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用
在誘變育種工作中，營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及應(yīng)用有著十分重要的意義。營養(yǎng)缺陷型菌株是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿基等)的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)缺陷的營養(yǎng)物質(zhì)才能正常生長繁殖的變異菌株。其變異前的菌株稱為野生菌株。凡是能滿足野生菌株正常生長的最低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)(MM)；在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酵母膏等，能滿足各種營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基(CM)；在基本培養(yǎng)基中只是有針對性的加入某一種或某幾種自身不能合成的有機營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株生長的培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)基(SM)。
營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選一般要經(jīng)過誘變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型和確定生長譜四個環(huán)節(jié)。誘變劑處理時與其它誘變處理基本相同。在誘變處理后的存活個體中，營養(yǎng)缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之幾至千分之幾，采用抗菌素法或菌絲過濾法，可以淘汰為數(shù)眾多的野生型菌株，從而達到濃縮營養(yǎng)缺陷型的目的。抗生素法是利用野生型菌株能在MM中生長，而缺陷型不能生長，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于“休眠狀態(tài)”，這時，加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。在選擇抗生素時，細菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 菌絲過濾法只適用于絲狀真菌，其原理是在基本培養(yǎng)基中，野生型的孢子能發(fā)芽成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型則不能。因此將誘變處理后的孢子在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，再進行過濾。如此重復數(shù)次后，就可以除去大部分野生型菌株，同樣達到“濃縮”營養(yǎng)缺陷型的目的。
營養(yǎng)缺陷型的檢出方法很多，主要有影印法、夾層法、逐個檢出法、限量補充培養(yǎng)法等四種。影印法是將誘變處理后的細胞涂布在完全培養(yǎng)基表面上，經(jīng)培養(yǎng)后長出菌落，然后用一小塊直徑比平皿稍小的圓柱形木塊復蓋于滅過菌的絲絨布上作為接種工具，將長出菌落的平皿倒轉(zhuǎn)過來，在絲絨上輕輕按一下，轉(zhuǎn)接到另一基本培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，比較這兩個平皿長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)前一平扳上某一部位長有菌落，而在后一培養(yǎng)基上的相應(yīng)部位卻沒有，就說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌落。夾層培養(yǎng)法是先在培養(yǎng)皿上倒一層基本培養(yǎng)基，冷凝后加上一層含菌液的基本培養(yǎng)基，凝固后再澆上一薄層的基本培養(yǎng)基。經(jīng)培養(yǎng)后，在皿底對首先出現(xiàn)的菌落做標記，然后再倒上一薄層完全培養(yǎng)基(或補充培養(yǎng)基)，再培養(yǎng)，這時再出現(xiàn)的新菌落，多數(shù)即為營養(yǎng)缺陷型。此法缺點是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。逐個檢出法是將經(jīng)過誘變處理的細胞涂布在完全培養(yǎng)基平板上，待長出單個菌落后，用接種針或牙簽將這些單個菌落逐個依次地分別接種到基本培養(yǎng)基和另一完全培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基上卻不長菌落，說明這是一個營養(yǎng)缺陷型菌株。限量補充培養(yǎng)法是將誘變處理后的細胞接種在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培養(yǎng)基上。野生型菌株就會迅速生長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型菌株只能形成生長緩慢的微小菌落，因而可以識別檢出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，則可直接在基本培養(yǎng)基上加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。
確定生長譜是指采用上法選出的缺陷型菌株經(jīng)幾次驗證確定后，還需確定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，還是維生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生長譜測定可以用兩種方法：一種是將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，洗滌培養(yǎng)基，制備成細胞懸液后，與MM培養(yǎng)基（融化并涼至50°C）混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的5~6個區(qū)間放上不同的營養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組織營養(yǎng)物的濾紙圓片，培養(yǎng)后會在組合區(qū)長出，就可測得所需營養(yǎng)。另一種方法是以不同組合的營養(yǎng)混合物與融化涼至50°C的MM培養(yǎng)基鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在什么組合長出可推知其營養(yǎng)因子。
營養(yǎng)缺陷型菌株不論在科學實驗中，還是在生產(chǎn)實踐中都具有廣泛的用途。利用營養(yǎng)缺陷型菌株定量分析各種生長因素的方法稱為微生物分析法。常用于分析食品中氨基酸和維生素的含量，因為在一定濃度范圍內(nèi)，營養(yǎng)缺陷型菌株生長繁殖的數(shù)量與其所需維生素和氨基酸的量成正比。這種方法特異性強，靈敏度高，所用樣品可以很少而且不需提純，也不需要復雜的儀器設(shè)備。 利用營養(yǎng)缺陷型菌株作為研究轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合等遺傳規(guī)律的標記菌種和微生物雜交育種的標記。由于微生物經(jīng)雜交育種后形成的雜種在形態(tài)上往往與親本難以區(qū)別，因此常常選擇不同的營養(yǎng)缺陷型來進行標記，通過測定后代的營養(yǎng)特性，以判斷它們雜交的性質(zhì)。利用營養(yǎng)缺陷型菌株測定微生物的代謝途徑，并通過有意識地控制代謝途徑，獲得更多的我們所需要的代謝產(chǎn)物，從而成為發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸、核苷酸和各種維生素等的生產(chǎn)菌種，例如利用絲氨酸營養(yǎng)缺陷型可以生產(chǎn)更多的賴氨酸，利用腺苷酸營養(yǎng)缺陷型菌株可提高肌苷酸的產(chǎn)量等。
4.3. 微生物的雜交育種
雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經(jīng)細胞的互相聯(lián)結(jié)、細胞核融合，隨后細胞核進行減數(shù)分裂，遺傳性狀會出現(xiàn)分離和重新組合的現(xiàn)象，產(chǎn)生具有各種新性狀的重組體，然后經(jīng)分離和篩選，獲得符合要求的生產(chǎn)菌株。盡管一些優(yōu)良菌種的選育主要是采用誘變育種的方法，但是某一菌株長期使用誘變劑處理后，其生活能力一般要逐漸下降，如生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢、產(chǎn)量增加緩慢、誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，常采用雜交育種的方法繼續(xù)優(yōu)化菌株。另外，由于雜交育種是選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，因此不論在方向性還是自覺性方面，都比誘變育種前進了一大步，所以它是微生物菌種選育的另一重要途徑。但由于雜交育種的方法復雜，工作進度慢，因此還很難象誘變育種那樣得到普遍的推廣和應(yīng)用。
4.3.1. 細菌的雜交
細菌的雜交行為是于1946年首次在大腸桿菌K-12菌株中發(fā)現(xiàn)并證實的。首先在大腸桿菌K-12菌株中誘發(fā)一個營養(yǎng)缺陷型(A—)、不能發(fā)酵乳糖(Lac—)和抗鏈霉素(SM r )以及對噬菌體T l敏感的突變體，可以寫成A—B +Lac—SM r T s1；另一菌株誘發(fā)成一個營養(yǎng)缺陷型(B—)，能發(fā)酵乳糖(Lac+)，對鏈霉菌敏感(SM s)和抗噬菌體T l的突變體A+B—Lac +SM s T r 1。這兩個菌株各自都不能在基本培養(yǎng)基上生長，如果把大約105 /ml濃度的上述兩種菌株混合在一起，并接種在基本培養(yǎng)基上，則能長出少數(shù)菌落；如果把上述兩種菌株分別接種到一個特制的U型管的兩端去培養(yǎng),中間用一片可以使培養(yǎng)液流通,但不能使細菌通過的燒結(jié)玻璃隔開,那么在基本培養(yǎng)基上就不會出現(xiàn)菌落。這說明細胞的接觸是導致基因重組的必要條件，即細菌通過接合完成了雜交行為。在鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、肺炎克氏桿菌、霍亂弧菌等許多細菌中也發(fā)現(xiàn)了沒接合現(xiàn)象，但是至今未在革蘭氏陽性菌中發(fā)現(xiàn)接合現(xiàn)象。細菌的雜交還可以通過F因子轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導等發(fā)生基因重組,但通過這些方式進行雜交育種獲得成功的報道還不多。
4.3.2. 放線菌的雜交育種
放線菌的基因重組于1955年至1957年首先在天藍鏈霉菌中發(fā)現(xiàn),以后在其它科、屬、種中相繼發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)在常用的放線菌雜交方法主要有三種,即混合培養(yǎng)法、平板雜交法和玻璃紙轉(zhuǎn)移法。國外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素產(chǎn)生菌的雜交育種方面都有過成功的報道,在我國幾乎與國外同時起步開展放線菌基因重組的研究工作,并取得了一定成效。
4.3.3. 酵母的雜交育種
一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細胞經(jīng)誘導雜交而形成二倍體細胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。酵母的雜交方法有孢子雜交法，群體交配法，單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運用罕見交配法更易獲得結(jié)果。
4.3.4. 霉菌的雜交育種
霉菌的雜交育種主要是通過體細胞的核融合和基因重組，即通過準性生殖過程而不是通過性細胞的融合。
霉菌的雜交育種的步驟為：第一 選擇直接親本。用來進行雜交的兩個野生型菌株叫原始親本。原始親本經(jīng)過誘變以后得到各種突變型菌株,假設(shè)這種菌株是用來作為形成異核體的親本,就叫直接親本。作為直接親本的遺傳標記有多種，如營養(yǎng)突變型、抗藥突變型、形態(tài)突變型等,目前應(yīng)用普遍的是營養(yǎng)缺陷型菌株。第二是異核體的形成。在基本培養(yǎng)基上,強迫兩株營養(yǎng)缺陷型互補營養(yǎng)，則這兩個菌株經(jīng)過菌絲細胞間的吻合形成異核體。由直接親本形成異核體的方法有：完全培養(yǎng)基液體混合培養(yǎng)法、完全培養(yǎng)基斜面混合培養(yǎng)法、液體有限培養(yǎng)基混合培養(yǎng)法、有限培養(yǎng)基平板異核叢形成法、基本培養(yǎng)基斜面銜接接種法、基本培養(yǎng)基平板穿刺法等。第三是雙倍體的檢出，檢出雙倍體的方法有很多種，如用放大鏡觀察異核體菌落表面，如果發(fā)現(xiàn)有野生型顏色的斑點和扇面，即可用接種針將其孢子挑出，進行分離純化，即得雜合雙倍體。或者將大量異核體孢子分離于基本培養(yǎng)基平板上從中長出野生型原養(yǎng)性菌落，將其挑出分離純化，即得雜合雙倍體。第四是分離子的檢出。可以用選擇性培養(yǎng)基篩選分離子，也可以將雜合雙倍體單孢子分離于完全培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至菌落成熟，檢查大量雙倍體菌落，在一些菌落上有突變顏色（隱性標記）的斑點或扇面出現(xiàn)，從每個菌落接出一個斑點或扇面的孢子于完全培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)后經(jīng)過純化和鑒別即得分離子。
4.4. 原生質(zhì)體育種
原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體誘變育種等。原生質(zhì)體融合育種是基因重組的一種重要方法，由于它具有一系列的特點，所以目前已為國內(nèi)外微生物育種學者所廣泛研究和應(yīng)用。
由于細胞壁是微生物細胞之間進行物質(zhì)交換的主要障礙之一，用一些方法將細胞壁去除后在高滲條件下形成類似球形的原生質(zhì)體，在原生質(zhì)體融合時又加入融合促進劑聚乙二醇（PEG）和Ca++，所以微生物原生質(zhì)體間的雜交頻率都明顯高于常規(guī)雜交法，霉菌與放線菌已達10—l ~10—2，細菌與酵母已達10-5~10-6。原生質(zhì)體融合受接合型或致育型的限制較小，二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。已報道的絲狀真菌種間的原生質(zhì)體融合主要是曲霉屬和青霉屬；屬間原生質(zhì)體融合主要在酵母中實現(xiàn)：熱帶假絲酸母×飾針復膜孢酵母，釀酒酵母×彭貝裂殖酵母等。原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程，因此可以想象遺傳物質(zhì)的交換更為完整，提高菌株產(chǎn)量的潛力更大。原生質(zhì)體融合可以是兩株以上的親株同時參與融合，如研究表明兩個親株的融合頻率為2.8×10-2，三個親株的融合頻率為4×10-4，四個親株的融合頻率為4.9×10-7。
原生質(zhì)體融合育種的步驟是：標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證 ，原生質(zhì)體制備，等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合，涂布于再生培養(yǎng)基、再生出菌落，選擇性培養(yǎng)基上劃線生長、分離驗證、挑取融合子進一步試驗保藏，生產(chǎn)性能篩選。
前面已經(jīng)提到轉(zhuǎn)化在工業(yè)微生物遺傳改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少數(shù)細菌外，多數(shù)微生物的自然轉(zhuǎn)化能力很低，特別是真核微生物幾乎很少能發(fā)現(xiàn)自然轉(zhuǎn)化。這主要是因為轉(zhuǎn)化的必備條件之一是感受態(tài)的存在，經(jīng)過人工誘導法可使一些微生物獲得感受態(tài)，已成功的例子如枯草芽抱桿菌、大腸桿菌等并得到廣泛應(yīng)用。但在鏈霉菌及真菌中，人工誘導法實現(xiàn)完整細胞的轉(zhuǎn)化的成功例子就不多了。原生質(zhì)體技術(shù)出現(xiàn)后不久，Bibb等發(fā)現(xiàn)，當有PEG存在時，質(zhì)粒DNA可以很高頻率轉(zhuǎn)化鏈霉菌原生質(zhì)體，從而徹底擺脫了轉(zhuǎn)化依賴感受態(tài)出現(xiàn)的限制。在真菌中巳成功地進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的菌株如釀酒酵母、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉等。
圖5－19. 基因工程技術(shù)的主要操作步驟示意圖
4.5. 基因工程技術(shù)用于工業(yè)菌種改良
基因工程技術(shù)又稱基因操作、基因克隆、DNA重組等，是一個將含目的基因DNA片段經(jīng)體外操作與載體連接，轉(zhuǎn)入一個受體細胞并使之擴增、表達的過程。因此比其它育種方法更有目的性和方向性，效率更高。其全部過程大體可分為以下6個步驟（如圖5－19）：目的基因的獲得；載體的選擇；含目的基因的DNA片段克隆入載體中構(gòu)成重組載體；將重組載體引入宿主細胞內(nèi)進行復制、擴增；篩選出帶有重組目的基因的轉(zhuǎn)化細胞；鑒定外源基因的表達產(chǎn)物。
目的基因的獲得 目的基因的獲得一般有四條途徑；從生物細胞中提取、純化染色體DNA并經(jīng)適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶部分酶切；經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA在體外合成互補DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及動，植物細胞中特定基因的克隆；化學合成，主要用于那些結(jié)構(gòu)簡單、核苷酸順序清楚的基因的克隆；從基因庫中篩選、擴增獲得，目前認為是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。
載體的選擇 基因工程中所用的載體系統(tǒng)主要有細菌質(zhì)粒、粘性質(zhì)粒、酵母菌質(zhì)粒、λ噬菌體、動物病毒等。載體一般為環(huán)狀DNA，能在體外經(jīng)限制酶及DNA連接酶的作用同目的基因結(jié)合成環(huán)狀DNA (即重組DNA)，然后經(jīng)轉(zhuǎn)化進入受體細胞大量復制和表達。
重組栽體的構(gòu)建 DNA體外重組是將目的基因用DNA連接酶連接到合適的載體DNA上，可采用粘端連接法和末端連接法。
工程菌的獲得 經(jīng)重組DNA的轉(zhuǎn)化與鑒定，得到符合原定的“設(shè)計藍圖”的工程菌。