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細(xì)胞的原代培養(yǎng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08
一、原理
將動物機體的各種組織從機體中取出,經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細(xì)胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。
二、儀器、材料及試劑
儀器:培養(yǎng)箱(調(diào)整至37℃),培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱(37℃)
材料:胎鼠或新生鼠
試劑:1640培養(yǎng)基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank’s液,碘酒
三、操作步驟
(一)胰酶消化法
1、器材:將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死,置75%酒精泡2—3秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi))再用碘酒消毒腹部,取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)(或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi))解剖取肝臟,置平皿中。
2、用Hank’s液洗滌三次,并剔除脂肪,結(jié)締組織,血液等雜物。
3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊(1mm2),再用Hank’s液洗三次,轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細(xì)胞分離。
5、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。
6、靜置5—10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
7、1000rpm,離心10分鐘,棄上清液。
8、加入Hank’s液5ml,沖散細(xì)胞,再離心一次,棄上清液。
9、加入培養(yǎng)液l—2 ml(視細(xì)胞量),血球計數(shù)板計數(shù)。
10、將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右,轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,37℃下培養(yǎng)。
上述消化分離的方法是最基本的方法,在該方法的基礎(chǔ)上,可進一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實驗室不同,所采用的消化酶也不相同(如膠原酶,透明質(zhì)酶等)。
(二)組織塊直接培養(yǎng)法
自上方法第3步后,將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶,貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上,將培養(yǎng)液加至瓶中,培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使組織浸入培養(yǎng)液中(勿使組織漂起),37℃繼續(xù)培養(yǎng)。
四、注意事項
1、自取材開始,保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
2、在超凈臺中,組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久,以免溶液蒸發(fā)。
3、凡在超凈臺外操作的步驟,各器皿需用蓋子或橡皮塞,以防止細(xì)菌落入。
五、無菌操作的幾個注意事項
1、操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2、點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3、操作動作要準(zhǔn)確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。
附:Hank’s液配方:
KH2PO4 0.06g,Nacl 8.0g,NaHCO3 0.35g,KCl 0.4g,葡萄糖1.0g,Na2HPO4•H2O 0.06g,加H2O至 1000ml
注:Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。
 
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