前段時間，經歷了幾個月的時間，為實驗室建了一個細胞培養間。目前這個細胞培養間運轉良好，培養的神經元長了10來天，長勢不錯，已經可以認為細胞培養室建立成功。在建立細胞培養間的過程中，碰到了許多問題，逐一解決后，覺得大家如果要建立細胞培養間，肯定也會碰到許多相同的問題，所以將我碰到的問題整理出來。首先向大家推薦一本書，個人認為是比較經典的——《動物細胞培養-基本技術指南》科學出版社，英，R.I.弗雷謝尼。內容不多，但以下的資料大部分是書上找不到的。

2005-4-30

陸新江

一、建細胞間的一些細節問題：

1、甲醛薰蒸：

資料（internet）：

40％甲醛溶液(藥用規格、福建三明化工總廠出品)，用量30 ml／m3，室內溫度21～24℃，相對濕度75％～85％，加熱薰蒸使蒸汽彌漫全室，關閉門窗1 h。

甲醛水溶液為無色，具有強烈刺激性氣味的液體，可殺滅多數微生物，價廉，熏蒸消毒時不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛。其主要用法為：
1．熏蒸消毒:　對室內消毒其用量為20－25%毫升/米，在加熱該溶液時最好同時煮沸一壺水，使室內相對溫度保持在70-90%左右，室內溫度最好在20攝氏度以上，作用時間12-24小時。如消毒皮毛服裝，甲醛水溶液的用量可加至125毫升/米,掛衣密度為每平方米3套為宜。熏蒸消毒時應密閉門窗。消毒后一般多用自然通風驅散甲醛氣體，其需時較長，急于排出氣體，可將25%氨水加熱蒸發中和。氨水用量為所用甲醛水溶液的一半，中和時間為30分鐘。
2．自然揮發: 將較大量的甲醛水溶液放入一敞開容器中，室內溫度保持在18攝氏度以上，同時室內噴水以保持相對濕度在70%以上，經16小時可達到室內消毒的目的。

關于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比較：甲酸的毒性比甲醇大6倍，甲醛的毒性比甲醇大30倍。所以吃進4~10克甲醇，就能引起慢性中毒。它的毒性作用主要表現在損傷視力，使視力減退（不能矯正），視野縮小，以致雙目失明，直到死亡。

實際操作：

我的每個房間是7個平方，約20個立方。按書上的算要福爾馬林300ml，高錳酸鉀100g。

高錳酸鉀放入甲醛液體中后，在開始的3秒鐘內沒有反映，3秒鐘以后，會產生大量煙氣。所以一旦在甲醛中加了高錳酸鉀請馬上離開滅菌室，并關上門。

高錳酸鉀放入甲醛液體中會使液體沸騰，所以反應要在比較大的大口徑容器進行，本人用的是臉盆。

甲醛氣體毒性非常強，所以操作時一定要帶上防毒面具。

2、關于紫外線：

資料：

紫外線的穿透能力非常弱的，主要靠電離產生氧自由基來消毒。細胞培養室里面一些不能照射紫外的物件可以用一般的材料蓋住。如：玻璃和有機玻璃都可以的。紫外有些人認為大型精密的顯微鏡是不可以照紫外的，因為它們的鏡頭上涂的膜會被分解掉，但我特意問了我校光學系的老師，他們認為是沒有關系的。

紫外線在許多實驗室被認為是起心理安慰作用的。我參觀過的一個細胞培養間他們的房間大約6平方米，但是只裝了30W的紫外燈，但前提是他們有一個層流系統。

個人認為，如果細胞培養間有層流系統，那紫外的作用是可以被忽略的，但如果沒有層流系統，那么紫外的作用還是相當重要。

此外，不要擔心紫外不能照射到的角落，因為紫外殺菌功能除了紫外本身以外，還可以由產生的臭氧來完成。

臭氧過量吸入的作用應該和雙氧水的作用是一樣的，個人認為也許有一定的致癌性。所以紫外滅菌以后，最好過一個小時再進去。

3、關于新潔爾滅：

資料：

【藥品名稱】苯扎溴銨溶液 (新潔而滅溶液) (乙類非處方藥【別 名】BenzalkoniumBromideSolution【標準來源】《中華人民共和國藥典》2000年版。【性 狀】 無色或淡黃色的澄明液體;芳香;味極苦;強力振搖能發生多量泡沫，遇低溫可能發生渾濁或沉淀。【藥物組成】每毫升含苯扎溴銨0.05克 (5%)。【作用類別】皮膚科用藥品。【藥理作用】苯扎溴銨為陽離子表面活性劑類廣譜殺菌劑。【臨床應用】用于皮膚黏膜和傷口的消毒。【用法用量】 外用，使用前應稀釋即配即用。皮膚消毒使用0.1%溶液；創面黏膜消毒用0.01%溶液； 稀釋方法：0.1%溶液：取本品一份，加純化水或清水50份；0.01%溶液：取本品1份，加純化水或清水500份。【注意事項】 l. 本品為外用消毒防腐藥，不可內服。2. 不得用塑料或鋁制容器貯存。3. 涂布部位如有灼燒感、瘙癢、紅腫等，應停止用藥，洗凈。必要時向醫師咨詢。4. 低溫時，可能出現混濁或沉淀，可置于溫水中加溫，振搖使溶解后使用。5. 兒童必須在成人監護下使用。【不良反應】偶見過敏反應。 【藥物相互作用】 l. 不得與肥皂或其他合成洗滌劑并用。2. 局部消毒時勿與碘酊、高錳酸鉀、雙氧水、磺胺粉等并用。 3. 如正在使用其他藥品，使用本品前請咨詢醫師或藥師。【規 格】500毫升﹕25克；100毫升﹕5克(5%)。【貯 藏】避光，密封保存。

評論：在甲醛滅菌前，先用新潔爾來擦洗整個墻面，此外，平時地板滅菌也可以用它。新潔爾滅和酒精相比，最大的優點是便宜，因為新潔爾滅500ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價格可能是新潔爾滅的幾十倍。

二、培養準備時的一些問題：

1、多聚賴氨酸：

資料：多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） 　

Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃
Thimerosal, 0.01%, added as preservative

多聚賴氨酸溶液是廣泛應用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產生較強的黏合力。
適用組織學，免疫組織化學，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實驗操作過程中組織掉片。也可用于細胞培養，增加細胞貼壁能力。

[使用說明]
免疫學
操作步驟（可直接在玻片上涂布）
1． 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。
2． 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內，使其溫度到室溫18-26℃
3． 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。
4．在60℃烘箱1小時干燥，或室溫18-26℃過夜干燥待用。

[注意]
1． 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過90張片子將影響其黏合力。
2． 用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。
3． 不要在用過的稀釋液中加新的溶液。
4． 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3個月內是穩定的。
5． 用過的稀釋液要過濾，若出現渾濁或長菌要丟棄。

2、洗液的一些問題：

資料：

重鉻酸鉀硫酸洗液
　　通常稱為洗潔液或洗液，其成分主要為重鉻酸鉀與硫酸,是強氧化劑。
　　K2Cr2O7 4H2SO4 K2SO4 Cr2(SO4)3 3[O]
　　因其有很強的氧化力，一般有機物如血、尿、油脂等類污遺跡可被氧化而除凈。事先將溶液稍微加熱，則效力更強。新鮮鉻酸洗液為棕紅色，若使用的次數過多，重鉻酸鉀就被還原為綠色的鉻酸鹽，效力減小，此時可加熱濃縮或補加重鉻酸鉀，仍可繼續使用。
　　配方：稀洗液 重鉻酸鉀 10g
粗濃硫酸 200ml
水 100ml
　　　　　濃洗液 重鉻酸鉀 20g
粗濃硫酸 350ml
水 40ml
　　配法：先取粗制重鉻酸鉀20g，放于大燒杯內，加普通水100ml使重鉻酸鉀溶解（必要時可加熱溶解）。再將粗制濃硫酸（200ml）緩緩沿邊緣加入上述重鉻酸鉀溶液中即成。加濃硫酸時須用玻璃棒不斷攪拌，并注意防止液體外溢。若用瓷桶大量配制，注意瓷桶內面必須沒有掉瓷，以免強酸燒壞瓷桶。配時切記，不能把水加于硫酸內（將因硫酸遇水瞬間產生大量的熱量使水沸騰，體積膨脹而發生爆濺）。
　　使用時先將玻皿用肥皂水洗刷1～2次,再用清水沖凈倒干,然后放入洗液中浸泡約2小時,有時還需加熱,提高清潔效率。經洗液浸泡的玻皿，可先用自來水沖洗多次，然后再用蒸餾水沖洗1～2次即可。
　　附有蛋白質類或血液較多的玻皿，切勿用洗液，因易使其凝固，更不可對有如酒精、乙醚的容器用洗液洗滌。
　　洗液對皮膚、衣物等均有腐蝕作用，故應妥善保存。使用時帶保護手套。為防止吸收空氣中的水分而變質，洗液貯存時應加蓋。

注意：

洗液具有強烈的腐蝕性，接觸皮膚后會，皮膚會變黃，2天后會脫一層皮。

3、氟尿嘧啶：

別 名：5?氟尿嘧啶 英 文 名：Fluorouracil (5 FU)。作用與用途：本品為嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉換成胸腺嘧啶核苷核，干擾DNA合成。對RNA的合成也有一定的抑制作用。

操作：在神經元培養時可以用來抑制膠質的生長。

4、L-谷氨酰氨：

資料：

氨基酸是組成蛋白質的基本單位.不同種類的細胞對氨基酸的要求各異,但有幾種氨
基酸細胞自身不能合成,必須依靠培養液提供,這幾種氨基酸稱為必需氨基酸.其中谷氨
酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺時,細胞生長不良而死亡.
因此,各種培養液中都有較大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定,應
置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培養液內.已含谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲
存2周以上時,還應重新加入原來量的谷氨酰胺.

三、海馬神經元培養的方法：

操作步驟：

1．取 2ml 左右的L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml） 包被培養板或coverlip；

2. 將出生小于24h的乳鼠6-8個用70%乙醇消毒，逐個斷頭，取腦，放入冰浴的解剖液中；

3. 用彎頭鑷鑷取海馬和皮層，去除腦膜和血管，分別放入干凈的平皿中，用手術刀片分別將海馬和皮層切細。

4. 將組織塊置于15ml解剖液配制的0.25%胰蛋白酶中，37ºC，靜置20min，取出時，勿搖晃。

5. 吸棄去上層胰酶液，下層組織沉淀約2ml, 加3ml種植液沖洗一遍。靜置約3分鐘。

6. 吸棄去上層液體，下層組織沉淀約2ml, 加3ml種植液沖洗一遍。離心800rpm×1min

7. 吸棄去上層液體，加2ml種植液

8. 用一根吸管，頭燒細，冷卻，輕輕吹打約15-20次，制成細胞懸液。

9. 取50ul細胞懸液稀釋到1ml, 計數4大格。

10. 細胞濃度=4大格細胞數/4×稀釋倍數×104/ml

11. 例如120/4×20×104/ml=6×106/ml

12. 按照0.6--2×106/ml的密度接種神經元。

13. 24h后全量換液成飼養液

14. 每三天用Neuronbasal使用液半量換液。

15. 接種后3-5天，加阿糖胞苷至終濃度10uM作用48小時，抑制膠質細胞的過度生長。

注意事項

1 用L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml） 包被培養板后，要待其干后才能接種，因為其對神經元有毒性。L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。

2 取腦組織時動作盡量要快，并且盡量低溫操作。

3 分離皮層和海馬時，要盡量分離腦膜和血管，否則有大量的成纖維細胞。

4 用吸管輕輕吹打細胞時，盡量不起泡沫，以免損傷神經元。

5 接種細胞的過程，動作要快，以免細胞聚集。

6 接種細胞后，24h勿移動，以免影響細胞貼壁。

四 結果：

大多數神經元在接種1h內貼壁，3-5h開始變平，并長出1-2個突起。3天后，許多細胞從胞體長出數個突起。神經元在7-10天開始成熟，胞體逐漸長至30-40um,暈光明顯，胞核和核仁清晰可見，突起變粗，變長并且有分支，邊緣清楚，發亮，形成明顯的神經網絡。神經元可存活1-2月。