一、原代細胞培養(yǎng)
(一)原理
細胞培養(yǎng)(Cell culture)是模擬機體內(nèi)生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等領域，發(fā)展成一種重要生物技術，并取得顯著成就。由體內(nèi)直接取出組織或細胞進行培養(yǎng)叫原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細胞離體時間短，性狀與體內(nèi)相似，適用于研究。一般說來，幼稚狀態(tài)的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養(yǎng)。
(二)操作
1．取材
用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。
2．切割
用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。
3．消化、接種培養(yǎng)
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(三)結果
細胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
二、傳代細胞培養(yǎng)
(一)原理
體外培養(yǎng)的原代細胞或細胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)。培養(yǎng)的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。
細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代后，一般經(jīng)過三個階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。
常用細胞分裂指數(shù)表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數(shù)／100個細胞。一般細胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好時期，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期)，適宜進行各種試驗。
(二)操作
1．將長成單層的原代培養(yǎng)細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘。
2.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應立即
在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細胞懸液。
3．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。
(三)結果
一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，2～4天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進行傳代。
三、器材及液體的準備和無菌操作的注意事項
(一)器材和液體的準備
細胞培養(yǎng)用的玻璃器材，如：培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤滅菌后備用；手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
(二)無菌操作中的注意事項
在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動超凈臺吹風。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養(yǎng)瓶要在超凈臺內(nèi)才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內(nèi)完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將尖端在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體。總之，在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。