一、微量全血培養(yǎng)
(一)原理
人體外周血中淋巴細(xì)胞是成熟的免疫細(xì)胞，正常情況下處于G。期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它動(dòng)物淋巴細(xì)胞的有絲分裂刺激劑，它能使處于G0期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞周期開(kāi)始旺盛的有絲分裂。
人體微量全血培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法。此法采血量少、操作簡(jiǎn)便，在 PHA作用下進(jìn)行短期培養(yǎng)即可獲豐富的、有絲分裂活躍的淋巴母細(xì)胞，適于制備核型標(biāo)本。各種因素的效應(yīng)(如病毒、電離輻射、化學(xué)藥劑等)也可在淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行觀察，從而進(jìn)行多種在體內(nèi)無(wú)法進(jìn)行的研究。因此它是細(xì)胞生物學(xué)及其它學(xué)科研究中的一種有效的方法。
(二)操作
1．打開(kāi)超凈臺(tái)紫外燈20～30分鐘。洗手、換潔凈白大衣后進(jìn)入操作室。啟動(dòng)超凈臺(tái)，點(diǎn)燃煤氣燈。用75％酒精棉球擦洗手、各種試劑瓶及操作臺(tái)面，然后將培養(yǎng)液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超凈臺(tái)。
2．在超凈臺(tái)內(nèi)將每個(gè)培養(yǎng)瓶裝入5ml培養(yǎng)液及0.2ml PHA溶液，封好備用。
3．用5ml注射器，7號(hào)針頭，先吸取少許肝素濕潤(rùn)針筒，然后從肘靜脈抽血l～2ml。
每個(gè)培養(yǎng)瓶接種全血O．2ml左右輕輕搖動(dòng)使血和培養(yǎng)液混勻。
4．在培養(yǎng)瓶上標(biāo)記好供血者姓名、性別、采血日期等，放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。每天輕輕震蕩培養(yǎng)瓶二、三次，防止血球沉積并保證血細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。
二、人淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備
(一)原理
在淋巴母細(xì)胞分裂高峰時(shí)加入秋水仙素，破壞細(xì)胞紡錘體的形成，使細(xì)胞停止在分裂中期。然后收集細(xì)胞，低滲處理，使細(xì)胞脹大，染色體伸展。接著進(jìn)行固定并除去中期分裂相中殘存的蛋白質(zhì)，使染色體清晰且分散良好。再結(jié)合離心技術(shù)去掉紅細(xì)胞碎片，然后采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標(biāo)本。
(二)操作
1．微量全血細(xì)胞培養(yǎng)至68小時(shí)左右，用1ml注射器 號(hào)針頭向每個(gè)5ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加2滴秋水仙素溶液，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，此項(xiàng)操作不需要嚴(yán)格無(wú)菌。
2．按時(shí)終止培養(yǎng)，用吸管溫和吹打成細(xì)胞懸液后，移至10ml離心管中。用天平平衡后以1000rpm離心8分鐘，棄大部上清，剩0.5ml。再吹打成細(xì)胞懸液，加入預(yù)熱37℃的 0.075mol／L的KCL溶液9ml，置37℃水浴中低滲處理30分鐘(這期間配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。
3.向離心管中加入1ml固定液預(yù)固定。平衡后以1000rpm離心8分鐘，同樣剩 0.5ml上清。
4．輕輕將細(xì)胞吹成懸液，加5~6ml固定液，室溫下固定30分鐘。然后離心，棄上清，重復(fù)固定一次。再離心，留0.1～0.2ml上清，吹打成細(xì)胞懸液。
5．吸取1～2滴懸液，在距載片約15cm高度滴于預(yù)冷的干凈載玻片上，迅速對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞吹氣促進(jìn)染色體分散。斜放載玻片，在空氣中晾干(此期間配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸緩沖液1:10)。
6．將標(biāo)本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分鐘，自來(lái)水沖洗，晾干后觀察。
(三)結(jié)果
低倍鏡下，制片質(zhì)量較好的標(biāo)本上可看到有較多的分裂相，染色體之間分散良好，互不重疊。
油鏡下觀察可見(jiàn)每一條染色體都含有兩條染色單體，兩條單體由著絲粒相結(jié)。分區(qū)計(jì)數(shù)染色體數(shù)目并判定性別，或拍照后進(jìn)行核型分析。
三、腫瘤細(xì)胞的染色體標(biāo)本制備
(一)原理
利用腫瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的特點(diǎn)，掌握其體外生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞便可獲得豐富的分裂相。腫瘤細(xì)胞染色體異常包括兩個(gè)方面：
1．結(jié)構(gòu)異常 即在腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)的染色體畸變，包括雙著絲點(diǎn)染色體、環(huán)狀染色體、斷裂的染色體、染色體裂隙及微小體等。
2．?dāng)?shù)目異常 由于腫瘤細(xì)胞分裂失去應(yīng)有的調(diào)控，可出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體和多一
倍體數(shù)目異常現(xiàn)象。
腫瘤細(xì)胞染色體制備技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床診斷、愈后觀察等方面均有廣泛用途。
(二)操作
l．以1.6× 105個(gè)／ml細(xì)胞濃度將FL—60細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，48小時(shí)后以終濃度為0.04μg／ml的秋水仙素處理2.5小時(shí)，移入10ml離心管。其余步驟與淋巴細(xì)胞染色體制備相同。
2.將長(zhǎng)成單層的HeLa細(xì)胞按1:2傳代進(jìn)行培養(yǎng)，36小時(shí)后用終濃度為0.04μg／ml的秋水仙素處理3小時(shí)。按時(shí)終止培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液處理單層細(xì)胞，待細(xì)胞收縮變圓時(shí)，棄去消化液。加入少許低滲液將細(xì)胞從瓶壁洗脫，移入10ml離心管，加入預(yù)熱37℃的低滲液至5 ~ 6ml，在37℃處理25分鐘。以下步驟同淋巴細(xì)胞染色體核型制備。
(三)結(jié)果
計(jì)數(shù)HeLa細(xì)胞和HL—60細(xì)胞的染色體數(shù)并尋找是否有畸變的染色體。
附：人體染色體常規(guī)核型的分析
一、人體染色體的觀察
取制備較好的染色體玻片標(biāo)本，先在低倍鏡下觀察。在標(biāo)本中選擇一個(gè)染色體之間分散較好，互不重疊的中期分裂相，置于視野中央，然后換油鏡仔細(xì)觀察。每個(gè)染色體都含有兩條染色單體，兩單體連接處為著絲粒。計(jì)數(shù)時(shí)要把分散的染色體劃分為幾個(gè)區(qū)域以免計(jì)數(shù)重復(fù)或遺漏，然后計(jì)數(shù)并判定性別。
二、核型分析的方法
人體染色體常規(guī)核型的分析，在今天的染色體研究水平上作為染色體結(jié)構(gòu)異常的疾病診斷已經(jīng)失去意義，但對(duì)染色體數(shù)目異常仍具有診斷上的價(jià)值，尤其是起著分析其它幾種顯帶核型的橋梁作用。通過(guò)常規(guī)核型的分析必須掌握三點(diǎn)：(一)會(huì)分組、(二)了解各組染色體的基本形態(tài)特征、(三)會(huì)計(jì)數(shù)數(shù)目和鑒定性別。
人體染色體的常規(guī)核型即按照Denver會(huì)議(1960年)提出的染色體命名和分類標(biāo)準(zhǔn)，將人類體細(xì)胞的46條染色體按大小、著絲點(diǎn)的位置分成七組(A、B、C、D、E、F、G、)23對(duì)的排列。
七組染色體的基本形態(tài)特征及分析順序是：
A組是七組染色體中最大的一組，首先找出它。A組包括三對(duì)，即第1~3號(hào)6條染色體，第1號(hào)為最大、是中央著絲點(diǎn)，長(zhǎng)臂近側(cè)有次縊痕；第2號(hào)第二大、著絲點(diǎn)略偏離中央；第3號(hào)為三大，是中央著絲點(diǎn)。
接著確定B組：B組二對(duì)即第4～5號(hào)4條染色體，較大，均為亞中著絲點(diǎn)，兩者不易區(qū)分開(kāi)。
第三確定D組和G組：D組三對(duì)即第13～15號(hào)6條染色體，中等大小均為近端著絲點(diǎn)，短臂末端有隨體。G組二對(duì)即第21～22號(hào)4條染色體，是最小的一組，均為近端著絲點(diǎn)，短臂末端有隨體，長(zhǎng)臂常呈分叉狀，21號(hào)稍小于22號(hào)。Y染色體被隸屬于該組，短臂無(wú)隨體，一般較2l、22號(hào)大點(diǎn)。
第四確定F組：F組二對(duì)即第19～20號(hào)4條染色體，染色體比G組稍大、均為中央著絲點(diǎn)。
第五確定E組：E組三對(duì)即第16～18號(hào)6條染色體，較小，第16號(hào)是中央著絲點(diǎn)，17、18號(hào)是亞中著絲點(diǎn)。
余者為C組：C組七對(duì)即第6～12號(hào)14條染色體，按大小順序依次排列，均是亞中著絲點(diǎn)；X染色體被隸屬該組，大小居6～7號(hào)之間，是亞中著絲點(diǎn)。
上述人的常規(guī)核型中，1～22號(hào)為常染色體，男女共有，另一對(duì)為性染色體，決定性別，男性為XY，女性為XX，人的正常核型寫(xiě)法：男46，XY；女46，XX。