一、DNA聚合酶或Klenow大片段介導的原位缺口平移(ISNT)
1.切片常規脫蠟,梯度乙醇復水化。
2.將切片組織浸入2×SSC液中,80℃,20min,然后蒸餾水沖盡。
3.0.5%胃蛋白酶(pH2.0)37℃消化0~20min,PBS洗盡。
4.用濾紙擦干組織塊周邊液體放入濕盒組織切片上滴加緩沖液A,5min。緩沖液A:50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl2, 10mmol/L β-巰基乙醇,0.005%BSA,pH7.5。
5.棄去緩沖液A,滴加標記液約50μl,25℃溫育1h。標記反應液:0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow大片段。
6.PBS漂洗2次,各3min。
7.內源酶阻斷劑阻斷15min。
8.PBS洗2次,各3min。
9.滴加HRP-avidin覆蓋組織,室溫下30min。
10.PBS洗2次,各3min。
11.DAB-H2O2顯色約5min。
12.流水沖洗后,蘇木素復染1min。常規脫水,透明,封片。
13.陰性對照片在第5步改加不含Klenow的標記液,余同。
二、TdT介導的dUTP缺口末端標記技術(TUNEL)
1.切片常規脫蠟,復水,后續過程在濕盒內進行。
2.3%的H2O2阻斷內源性辣根過氧化物酶30min。
3.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
4.切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
5.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
6.蛋白酶K或胃蛋白酶消化0~20min。
7.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
8.TdT緩沖液孵育10min。
9.TdT反應液37℃孵育1h。
10. 切片浸泡在2×SSC溶液10min,以終止反應。
11. 0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
12. 鏈卵白素標記的辣根過氧化物酶孵育30min。
13. 0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
14. 0.04%的DAB顯色5~10min,鏡下控制時間。
15. 蘇木素復染3~5min,常規復水,透明和封片。