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4小時51Cr釋放法檢測CMC活性

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

一、用51Cr鉻酸鈉標(biāo)記靶細(xì)胞

短期標(biāo)記法

1.用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌107靶細(xì)胞,去上清液。用0.5ml不含碳酸氫鈉的完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。加入100μCi(3.7MBq)51Cr鉻酸鈉,37℃水浴中標(biāo)記1小時,每5~10分鐘搖晃一次,混勻細(xì)胞。

2.如上用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,每次400×g 10分鐘。用50ml RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,置37℃水浴30分鐘,以減少非特異的自然釋放。

3.離心200×g 10分鐘,去上清液。小心用RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,盡量減少振蕩引起的細(xì)胞損傷以降低靶細(xì)胞的自然釋放率,將細(xì)胞濃度調(diào)整為0.5×105或1×105/ml備用。


二、4小時51Cr釋放實驗

1.在96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞,每孔加100μl。

2.向各孔加100μl效應(yīng)細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例(效靶比,E:T)根據(jù)要求而定,通常為5:1~20:1。陰性對照孔(自然釋放)不加效應(yīng)細(xì)胞只加100μl完全培養(yǎng)液,陽性對照孔(最大釋放)中加100μ1%NP40(或2%SDS,1mol/L鹽酸)。每個實驗置三個復(fù)孔。

3.稍稍離心(100×g 3分鐘)后,置37℃ 5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。

4.離心培養(yǎng)板200×g 10分鐘,每孔吸出100μl上清液置一次性使用的檢測管中,在γ-計數(shù)儀上(或液閃計數(shù)儀上)測定上清液中的每分鐘放射性活性(cpm值)。


3)特異性殺傷活性的計算

1.用細(xì)胞毒性百分比表示:細(xì)胞毒性(%)=[(實驗組cpm-自然釋放組cpm)/(最大釋放組cpm-自然釋放組cpm)]×100%

2.用溶解單位(lytic unit,LU)表示:一個LU是指能溶解一定數(shù)量靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)。通常將能溶解30%靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)定位一個LU。結(jié)果以106個效應(yīng)細(xì)胞所具有的LU數(shù)表示:LU30/106細(xì)胞=106/[(E:T30)×(每孔靶細(xì)胞數(shù))] E:T30是該效靶比時效應(yīng)細(xì)胞能殺傷30%靶細(xì)胞

 
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