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[3H]脫氧胸苷攝入細(xì)胞計(jì)數(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

1.用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌對數(shù)生長期(培養(yǎng)3天)的CTLL-2細(xì)胞兩次,每次250×g離心10分鐘,洗去培養(yǎng)液中殘存的IL-2。

2.用臺(tái)盼藍(lán)(1% Trypan blue)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞并決定細(xì)胞的活力,用10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞至1×105/ml。

3.在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加0.1ml倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)IL-2或待測樣品,每個(gè)稀釋度三個(gè)復(fù)孔,標(biāo)準(zhǔn)IL-2從40 IU/ml稀釋到0.019 IU/ml(8~10個(gè)稀釋度),陰性對照孔不加IL-2。

4.每孔加0.1ml細(xì)胞懸液,在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時(shí)。每孔加10μl(0.5μCi或1.85×104Bq)[3H]脫氧胸苷,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。

5.用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集到玻璃纖維濾紙上,用3%醋酸水溶液濾紙3次,洗去游離的[3H]TdR。將濾紙置液體閃爍瓶中,加入5ml閃爍液。在液體閃爍儀上計(jì)數(shù)細(xì)胞攝入的同位素活性(每分鐘放射性計(jì)數(shù),cpm),根據(jù)儀器效率換算成dpm(每分鐘衰變數(shù))。

6.用dpm值對樣品稀釋倍數(shù)作圖。在圖上,標(biāo)準(zhǔn)IL-2的曲線與待測樣品的曲線應(yīng)當(dāng)呈平行的S型,說明是同樣的分子反應(yīng)。比較同樣dpm處的不同稀釋倍數(shù),決定待測樣品的相應(yīng)濃度。

 

 
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