（一）動物的選擇與免疫

　　1．動物的選擇 　純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環境潔凈的實驗室均能飼養成活。目前開展雜交瘤技術的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）

　　↓3周后

　　第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價）

　　↓2～3周

　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內注射）

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，增強免疫細胞對抗原的反應性。

　　（2）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

取脾融合

　　（二）細胞融合

　　1．細胞融合前準備

　　（1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處于對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

　　（2）飼養細胞：在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。在制備McAb的過程中，許多環節　需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

　　2．細胞融合的步驟

　　（1）制備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周齡

　　↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）

　　↓

　　反復沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養

　　（2）制備免疫脾細胞

　　最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾臟，培養液洗 一次

　　↓

　　脾臟研碎，過不銹鋼篩網

　　↓

　　離心，細胞用培養液洗2次

　　↓

　　計數

　　↓

　　取108脾淋巴細胞懸液備用

　　（3）制備骨髓瘤細胞

　　取對數生長骨髓瘤細胞離心

　　↓

　　用無血清培養液洗2次

　　↓

　　計數，取得×107細胞備用

　　（4）融合

　　①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。

　　②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④離心，800rpm, 6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

　　⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。

　　（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

　　1．HAT選擇雜交瘤細胞 　　　脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。

　　在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天后應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。

　　2．抗體的檢測　　 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。

　　（四）雜交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　　（1）克隆前1天制備飼養細胞層（同細胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹干，計數。

　　（3）調整細胞為3～10個細胞/ml。

　　（4）取頭天準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。

　　（5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

　　（6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

　　（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。

　　（8）每個克隆應盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養法克隆

　　（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

　　②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　　（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　　（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

　　（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　　（5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　（6）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養細胞的24孔中進行培養。

（7）檢測抗體，擴大培養，必要是地再克隆化。

　　（五）雜交瘤細胞的凍存與復蘇

　　1．雜交瘤細胞的凍存　　 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞砜）。

　　凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。

2．細胞復蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。

　　（六）單克隆抗體的大量生產

　　大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　（1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產，費用較高。

　　（2）體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

　　①實體瘤法：對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制備：常規是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復蘇后轉種小鼠腹腔則產生腹水塊、量多。

　　（七）單克隆抗體的鑒定

　　對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的，應做下述幾個方面的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應該用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應該用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標準抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定 　　　用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4．McAb識別抗原表位的鑒定　　用競爭結合試驗，測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

　　5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。