1) 傳代培養細胞染色體顯示法
1.培養細胞:取處于指數生長期、用較大瓶皿培養的、80%~90%匯合單層培養細胞。
2.加秋水仙素:使用最終濃度為0.02~0.8微克/毫升營養液,溫箱繼續培養6~10小時;或用低溫封閉法:把培養細胞置于4℃條件下6~12小時后,再于37℃溫箱繼續培養6~10小時處理(加秋水仙素)。
3.采集分裂細胞:可利用分裂中期細胞體變圓與底物附著不牢特點,此時手持培養瓶,左右反復橫向水平搖動,令培養液在培養細胞表面反復沖刷。應用此法可使90%的中期分裂細胞從瓶壁脫落,注意勿用力過猛,以防多量非分裂細胞脫落影響觀察。
4.離心:收集培養液,1000轉/分鐘離心5~10分鐘。
5.低滲處理:吸除上清液、加入預溫至37℃的0.075M KCl溶液,在溫箱中靜置20~30分鐘。
6.預固定:向懸液中加新鮮1:3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打調勻,此措施能起到先使細胞表面輕微固定,可防止固定后細胞粘連成塊。
7.固定:離心,同4,吸除上清液,加新鮮固定劑5~10ml;加固定劑時要用一手微斜持離心管,另手用吸管吸取固定劑,把固定劑逐滴滴在離心管壁上,使之慢慢流入離心管中,然后輕輕吹打均勻,置15~20分鐘。
8.重復7,末次離心后,小心吸除大部分上清,據懸液中細胞密度大小,余下固定液0.5~1ml。
9.制片:用滴片法制片,按如下步驟:徹底洗凈載物片,勿留任何油脂,置冰箱中儲備備用。滴片前現從冰箱中取出冷載物片1片,在載物片表面出現細微水氣時,立即向片的一側滴2~3滴細胞懸液,滴片時的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥,或用吹風機熱風吹干亦可。如此制備好的標本可置盒中備用或立即進行染色觀察。
10. 染色和封片:一般常用Giemsa染色:取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸緩沖液9份混合,染色10分鐘后,水洗、晾干、可直接觀察。如標本需要保存或做長時間觀察,可過二甲苯兩次后,用中性樹膠封片后,再過二甲苯,然后封片亦可。
2) 人末梢血微量全血培養染色體顯示法
1.培養液準備:取15ml培養瓶數個,每瓶內分別充入5ml培養液(pH 7.2),內含:1640培養液(含10%~15%小牛血清),PHA 0.1ml,青霉素100單位和鏈霉素100微克/毫升 培養液
2.抽血針管準備:取2~5ml針管一支,在消毒后的無菌操作臺或無菌操作箱中安裝好注射器,無菌抽肝素(100 U/ml BBS)少許濕潤針管,如動作迅速不用肝素亦可。
3.采血:用棉簽75%酒精給患者或獻血者的皮膚消毒兩次,縛止血帶,靜脈取血1~2ml。無菌操作迅速向每一瓶培養中加血0.4~0.5ml,如系外出采血,安裝針管及分裝血液兩步驟亦可在無菌條件略差的環境內操作,但動作要迅速,以減少污染;在采血量不多或不應抽血的情況下,亦可在耳垂、手指肚(無名指)用刺血針采血。
4.培養和加秋水仙素:37℃溫箱中培養到60~72小時之間,此時細胞分裂相最多,向每培養瓶內加秋水仙素,最終濃度0.02~0.08微克/毫升營養液,再培養4~6小時。
5.低滲:1000轉/分鐘離心10分鐘,吸除上清液,加入預溫過的0.075M KCl溶液10ml,置溫箱中低滲處理15~20分鐘。
6.其余步驟與處理傳代細胞法相同。