★植物組織培養（Plant Tissue Culture）：是指通過無菌操作分離植物體的一部分（外植體explant），接種到培養基上，在人工控制的條件下（包括營養、激素、溫度、光照、濕度）進行培養，使其產生完整植株的過程。（主要有原生質體（Protoplast），懸浮細胞，組織（愈傷組織Callus、莖尖分生組織），器官（胚，花藥，子房，根和莖）的培養。其中最常見的是愈傷組織培養。）
★愈傷組織（Callus）：原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞，在組培中則指人工培養基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細胞。
★植物細胞全能性（Cellular totipotency）：任何具有完整細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植珠所必須的全部遺傳信息和發育成完整植株的能力。（Haberlandt, 1902）
★微（快）繁步驟（micropropagation）：
母株（完整）→外植體（母株的一小部分，種子亦可）→接種到培養基上→長芽（繼代增殖）→長根（試管外生根亦可）→練苗，馴化→完整植株
★組培發展簡史：細胞學說：Schleiden和Schwann。1.探索：20世紀初，Haberlandt提出“細胞全能性” （1902）；1904年，Hanning培養蘿卜和辣根菜的胚成功；Laibach（1925,1929）亞麻種間雜種胚培養成功，證明胚培養在植物遠緣雜交上可利用；1922年，Robiins（美）和Kotte（德）離體根尖培養成功。2.奠基：Gautheret，White和Nobecourt，組培奠基人。White和Gautheret發現了 B族維生素和生長素；Skoog（1944）和Skoog和崔 （1951）等發現腺嘌呤和生長素的比例控制芽和根的形成，Overbeek等（1941）首次將椰子汁（CM）作為添加劑，Steward等在胡蘿卜組培也使用CM；1952年，Morel和Martin首次證實通過莖尖離體培養可獲無病毒植株；1953-1954年，Muir單倍體培養獲得成功；1955年，Miller分離出激動素（KT）；1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；1958年，Steward首次證實Haberlandt的細胞全能性設想；Wickson和Thimann指出CTK打破腋芽休眠；Murashige發展快繁技術；1958-1959年，Reinert和Steward胡蘿卜愈傷組培中形成體細胞胚。3.迅速發展：1971年，Takebe首次由煙草原生質體獲得再生植株；1972年，Carlson獲得煙草的第一個體細胞雜種；1964年，Guha和Maheshwari由毛曼佗羅離體花藥培養胚；1960年，Morel提出離體無性繁殖蘭花。……（具體see see書本或課件）
★組培意義：1、基礎理論研究（試驗體系的準確性和可重復性，廣泛用于細胞、組織的代謝生理及其它生化等方面的研究（如分化問題））。2、應用研究（無性繁殖系快速繁殖的生產、試管苗的商品化，遺傳育種，種質保存，克服遠緣雜交，種質資源創新，獲得轉基因植株）。
★組培應用前景：1、作物育種上的應用（1、花藥和花粉培養2、胚胎培養3、細胞融合4、基因工程5、培養細胞突變體6、種質保存）2、作物脫毒和快繁上的應用（馬鈴薯，蘭花）3、在植物有用產物生產上的應用4、在遺傳、生理、生化和病理研究上的應用。
★植物激素調控：auxin/CTK >1(促進生根) ；=1(愈傷組織) ；<1(促進發芽)
★脫分化（dedifferentiation）：在組織培養中，不分裂的靜止細胞，放在一定的培養基上后，細胞重新進入分裂狀態。一個成熟的細胞轉變為分生狀態的過程叫脫分化。
★再分化（redifferentiation）：一個成熟的植物細胞經歷了脫分化后，能再分化而形成完整植株的過程。
★再分化途徑：1、器官發生方式（是指在外植體或愈傷組織的不同部位分別獨立形成莖、芽和根，它們為單極性結構，各有維管束與外植體或愈傷組織相連，但在不定芽和不定根之間沒有共同的維管束將兩者連在一起。）2、胚胎發生方式（外植體直接或通過愈傷組織或懸浮培養產生胚狀體。）
★胚狀體（embryoid）：是指在組織培養中起源于一個非合子細胞，經過胚胎發生和胚胎發育過程形成的具有雙極性的胚狀結構。其特點有：1、不同于合子胚，因為它不是兩性細胞融合產生。2、不同于孤雌/雄胚，因為它不是無融合生殖的產物。3、不同于器官發生方式形成的莖芽和根，因為它經歷了與合子胚相似的發育過程且成熟的胚狀體是雙極性結構。
★器官發生途徑：1、莖尖或莖段培養產生腋芽。2、直接不定芽發生：器官的小塊組織在培養基上培養直接誘導產生不定芽。3、間接不定芽發生：器官的小塊組織在培養基上培養后先去分化形成愈傷組織，再經分化誘導產生不定芽或不定根。
★胚胎發生方式：1、直接胚胎發生（從培養物中的器官組織，細胞或原生質體直接分化成胚，中間不經過愈傷組織）2、間接胚胎發生（外植體先愈傷化，然后由愈傷組織細胞分化成熟）
球型胚（global embryo）→心型胚（heart-stage embryo）→魚雷型胚（torpedo-stage embryo）→子葉型胚（cytoledon-stage embryo）
★人工種子：是指利用細胞的全能性將離體培養所產生的體細胞或具有發育成完整植株能力的分生組織（胚狀體，莖和莖段）包裹在一層含有營養物質并具有保護功能的外膜內形成在適宜條件下能夠發育成完整植株的小顆粒。
結構包括人工種皮，胚狀體（分生組織），人工胚乳。
★植物組織培養應用步驟：1、獲得無菌外植體，建立起無菌培養體系。2、進行增殖，不斷產生不定芽或胚狀體。3、生根培養。4、試管苗移栽。
★外植體選擇的原則：1、必須含有活細胞。2、幼嫩組織所含活躍分裂的細胞比例高。3、母珠必須健康并且無任何腐爛或生病的跡象。4、母珠必須活躍生長并且不會立即進入休眠。
★外植體的確定選擇：1、莖尖（園藝植物組織培養中應用最多，繁殖率高，不易發生遺傳變異，但取材有限）；2、莖段（采用嫩莖的切段促進腋芽萌發，取材容易）；3、葉（幼嫩葉片組織通過愈傷組織或不定芽分化產生植株，取材容易，操作方便，但易發生變異）；4、花球和花蕾；5、種子、根、塊根、塊莖、花瓣等。
★消毒的原則：消毒劑與外植體應接觸足夠長的時間以除去外植體表面的微生物，但應盡量減少對外植體細胞的破壞。
★消毒方法：沖洗植物材料除去泥土等大的顆粒→浸入70-75％乙醇，有利于植物表面的浸濕→用5-20％NaClO溶液（加1滴表面活性劑）表面消毒5-10min→用無菌水沖洗至少3遍→與消毒劑接觸過的切面在轉移到無菌培養基前應切去，因為消毒劑會殺死外露的細胞從而影響營養吸收→切取外植體，通常為10mm的莖段和直徑10mm的葉片部分（太大激素作用減弱，太小則不易成活）。
★消毒注意事項：1、表面消毒劑對植物組織是有害的，應正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。2、在表面消毒后，必須用無菌水漂洗材料3次以上以除去殘留殺菌劑，但若用酒精消毒，則不必漂洗。3、與消毒劑接觸過的切面在轉移到無菌基質前需將其切除，因為消毒劑會阻礙植物細胞對基質中營養物質的吸收。4、若外植體污染嚴重則應先用流水漂洗1小時以上或先種子培養得到無菌種苗，然后用其各個部分建立組織培養。5、HgCl2效果最好，但對人的危害最大，用后要用水沖洗至少5次。
★莖尖培養：切取莖的先端部分或莖的分生組織部分進行無菌培養。
步驟：無菌培養的建立→芽的誘導→生根培養→試管苗的移栽（遺傳變異）
注意點：試管苗移栽過程中，由異養→自養，恒溫→溫差，無菌→有菌，光弱→光強，濕度高→濕度低，應該保持苗的水分平衡（加塑料薄膜和使用噴霧機），選擇適當的基質，注意光、溫的條件。
★安祖花：葉片→誘導愈傷組織→誘導芽→誘導根 生根
↓ ↑
增殖→切根→芽的增殖→再培養→壯苗→生根之前
不定胚的誘導：組織片→含有2,4-D的培養基上→產生不定胚→去除2,4-D的培養基上→球型胚→心型胚→魚雷型胚→植物體。
不定芽的誘導：用BA誘導，在球、心、魚雷時要去除BA。
★胚胎培養的意義：1、對于胚乳發育不良或胚與胚乳間不親和的材料進行離體胚培養，有助于遠緣雜交獲得成功。2、為研究胚在各個發育時期的營養需要提供了一個很好的機會。3、能對整個胚及其各部分的再生潛力進行研究。
★胚培養中的兩個重要問題：1、胚剝離的方法：剝離的最佳時間是授粉后13-15天。2、培養基的成分：找到合適的培養基，在胚培養中加入蔗糖（能源、保持適當滲透壓）。
★花藥培養方法：
取材地點：大田和溫室
取材：大多采用單核期的花粉培養，因誘導產生愈傷組織或胚狀體的頻率較高。
花粉時期的確定：常采用醋酸洋紅-碘化鉀染色，再壓片鏡檢。實際操作中常根據花蕾長度、大小與花粉年齡的相關性確定。
預處理：低溫、高溫或交叉處理
培養基：有MS，Nitsch，Miller，B5和N6。低濃度的生長素和細胞分裂素相結合，高濃度的蔗糖對花粉的誘導生長有一定作用。培養基中加入活性炭對提高誘導頻率也有一定效果。
消毒、接種和培養：花藥→在燒杯中研碎（有溶劑）→過濾→濃度梯度離心→收集中間層→離心
單倍體的鑒定和加倍處理：單倍體用2％秋水仙素處理24小時，愈傷組織細胞自然加倍。
★花粉花藥培養的意義：1、在單倍體細胞中只有一個染色體組，表現型和基因型一致，一旦發生突變，無論是顯性還是隱性，在當代就可表現出來，因此單倍體是體細胞遺傳研究和突變育種的理想材料。2、在品種間雜交育種過程中，通過F1代花藥培養得到單倍體后，經染色體加倍立即成為純合二倍體，從雜交到獲得不分離的雜種后代單株只需要2個世代和常規育種相比，顯著縮短了育種年限。
★花藥培養步驟（用改良的NLN培養基）：
F1代花藥→形成小孢子→分離小孢子→形成愈傷組織→形成胚→單倍體植株→純合二倍體
↓
形成胚→單倍體植株→染色體加倍形成純合二倍體
★原生質分離：酶（纖維素酶，離析酶）
步驟：葉片表面消毒→去除表皮→葉碎片漂浮在含有酶和滲透壓穩定劑的溶液中→培育→原生質體沉到培養皿底部→除去酶溶液→將原生質體移入CPW清洗→離心→清洗基質兩次→重懸浮于培養基→除去小的個體，用血球計計數→調整到合適的密度重懸浮于培養基。
★原生質體的培養：
培養基：MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇
注意：1、原生質體分離后，非常脆弱，需要滲透壓保護劑的保護直到細胞壁形成。
2、針對不同的研究對象，培養基中生長素和細胞分裂素的水平要做適當調整。
影響原生質體培養的因素：營養需求（NH4＋不能過多），滲壓劑，培養密度（105/mL），
貯藏條件（通常在黑暗處）。
培養方法：液體基質培養法，半液體基質培養法，固體基質培養法，看護培養。
固體培養的步驟：原生質體移入培養基→1體積含原生質體的培養基與1體積含瓊脂糖（40℃）的培養基混和→倒轉培養皿在25℃下培養→原生質體重新產生細胞壁并分裂成細
胞團→細胞團于瓊脂糖基質中傳代培養，培養基中應減少滲壓劑以利于愈傷組織的形成→誘導分化成植物的根，莖。
★原生質體分離培養的意義：1、除去了細胞壁為植物細胞之間的融合掃平了障礙，同時葉為制造新雜種開辟了道路。2、原生質體可攝入外源DNA，細胞器、細菌或病毒顆粒，這些特性與植物全能性相結合為高等植物的遺傳飾變打下基礎。3、獲得細胞無性系和選育突變體的優良起始材料。
★原生質的融合概念：從同一個種或不同種分離得到的原生質體在適當的條件下融合得到細胞核物質和細胞質物質的混和。
★體細胞雜交：完全不經過有性過程，只通過體細胞融合制造雜種的方法稱為體細胞雜交。
★原生質體融合方法：自發融合，誘發融合（NaNO3處理，高PH-高濃度鈣離子處理，PEG處理，電融合）
PEG法：
取材（1、從綠色葉片上分離得到的原生質體。2、來源于同種或不同種的細胞懸浮培養物上分離出的無色原生質體）－這樣異核體和母體就可分辨開。
→分別取在含有13％甘露醇的CPW上懸浮培養的原生質體（密度2×105）4mL，混和在100g的轉速下離心10min，將原生質體放入0.5％基質→加入30％（w/v）PEG 2mL，使原生質體的外膜不穩定，放置10min→每隔5min加入原生質體培養基稀釋PEG以促進原生質體融合。每次稀釋后輕微搖動原生質體就會重懸浮→混和物在100g下離心10min，離心后在不含PEG的培養基中清洗→離心，在相同的培養基上重懸浮。
PEG法的缺點：有毒，融合率低：不超過1％
對稱融合：父母均未處理，對后代貢獻一樣。
不對稱融合：父母本在后代中貢獻不同，射線處理，化學處理
IOA（不影響核的分裂而影響細胞質分裂）
★胞質雜種：利用原生質體融合技術，使兩種不同來源的核外遺傳成分（細胞器）與一個特定的核基因組結合在一起，就形成胞質雜種。
體細胞雜種和胞質雜種的鑒定方法：形態學，細胞學，分子遺傳學。
★園藝植物脫毒：
熱處理脫毒：
原理：在高于正常溫度下，植物組織中的很多病毒可被部分或完全鈍化，而很
少傷害甚至不傷害寄主組織。
方法：熱水處理（對休眠芽效果好），熱空氣處理（對活躍生長的莖尖效果好）
熱空氣處理方法：空氣溫度35-40℃，持續時間：隨處理對象不同而變化，幾分鐘-幾星期。
注意點：不能一下子放入高溫中，要逐步加溫使之適應。并保持濕度和光照。
局限性：1、并不是所有的病毒都對熱處理敏感
2、對等徑和線狀的病毒及類菌質體引起的病害是有效的。
3、熱處理后只有一小部分植株能夠存活
★莖尖分生組織：指莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑約100μm，最大長度為
250μm。
★莖尖：由頂端分生組織及其下方的1-3個葉原基一起構成的。
★莖尖培養脫毒：
原理：病毒在植物體內的分布是不均勻的，在受感染的植物中頂端分生組織通常不含或僅含低濃度的病毒，其它的植物組織離莖尖的距離越遠則病毒含量越高。
影響莖尖培養脫毒效果的因素：培養基，外植體大小（脫毒效果跟外植體大小呈負相關，莖尖的成活率與莖尖大小呈正相關），貯存條件（光照培養優于暗培養），外植體的生理狀態（活躍生長的芽，頂芽的效果比腋芽好，切割芽的時間）
★通過愈傷組織培養脫毒：
原理：在由受感染的組織形成的愈傷組織中，并非所有的細胞都均勻一致地帶有該種病原體。
產生原因：1、病毒的復制速度跟不上細胞的增殖速度
2、有些細胞通過突變獲得了抗病毒的特征。
★脫毒植物的鑒定：外觀判斷法，指示植物法（接種鑒定法），抗血清鑒定法，電鏡檢查法，
分光光度法，酶聯血清免疫吸附反應鑒定法。
指示植物法：利用病毒在其它植物上產生的枯斑作為鑒別病毒的標準。
指示植物：專門選用以產生局部病斑的寄主稱為指示植物。
★無毒原種的保存：種在溫室或防蟲罩內滅過菌的土壤中，隔離區內，通過組織培養繁殖。
組培常見英漢對照
abortion（敗育）adenine（腺嘌呤）agar （瓊脂）anther（花粉）apical（頂端的）aseptic(無菌的) auxin（生長素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈傷組織）cellular totipotency（細胞全能性） cellulase（纖維素酶）cellulose（纖維素）centrifuge（離心）chloroplast（葉綠體） chromosome doubling（染色體加倍）colony（細胞團，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞質雜種） cytokinin（細胞分裂素） cytoplasm（細胞質）degeneration （敗育）dedifferentiation （脫分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（雙子葉的）dihaploid（二單倍體）diploid（二倍體）dissect（剝離）dormancy（休眠）eliminate （除去） embryo（胚胎）embryoid（胚狀體）embryogenesis（胚胎發生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植體）filter paper（濾紙） gelose（瓊脂糖）genetype（基因型）germplasm（種質） global embryo （球型胚） haploid（單倍體）heterokaryon（異核體）homozygous（純合的）hormone （激素）interspecific（種間的）intraspecific（種內的）in vitro（體外）in vivo（活體）kinetin（激動素）macerozyme（離析酶）male sterile（雄性不育）medium（培養基）membrane（膜）meristem（分生組織）meristem culture（莖尖培養）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（單子葉植物） nod culture （莖段培養）organelle（細胞器）organgenesis（器官發生方式）osmotic（滲透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture（花粉培養）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球莖protoplast fusion（原生質體融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不親和） shoot tip（莖尖） sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（體細胞胚）somatic hybridization（體細胞雜交）somatic hybrid（體細胞雜種）stem（莖）stem tip culture（莖尖培養）sterilant（消毒劑）sterile distilled water（蒸餾水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (繼代) sucrose（蔗糖） terminal bud（頂芽）transfer （轉移）virus eradication（脫毒）
常用縮略語
ABA（脫落酸） CM（椰子汁） CPW（細胞-原生質體清洗液）
DMSO（二甲基亞砜） IAA（吲哚乙酸） IBA（吲哚丁酸）
KT（激動素） NAA（萘乙酸） PEG（聚乙二醇）
LH（液氮） CH（水解酪蛋白） GA3（赤霉素）