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免疫組化非特異性背景染色及其控制方法

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-27

一、非特異性染色的識別
常出現在組織邊緣、膠原纖維及血漿滲出處,壞死組織及固定不良的組織中心處。表現為彌漫性,均勻性的背景染色。也可以是隨機分布的陽性反應產物點、團或塊狀。
二、非特異性染色的原因
1. Ig與Fc受體結合
多見于冰凍切片(特別是淋巴造血組織,淋巴細胞,單核細胞,組織細胞表面多),主要是和二抗反應,因為一抗一般稀釋度均較大,因此Fc受體的干擾基本不存在。由于福爾馬林固定破壞了大部分的Fc受體,所以石蠟切片不多見。
避免方法:
① 用以二抗相同種族的正常血清封閉切片;
② 用不含Fc段的抗體,但價格貴
(V區,C1區不含Fc段,用Pepsin消化)

2.靜電吸附
抗體是一種帶負電荷的球蛋白,容易和帶正電荷的組織相結合,如膠原纖維。

避免方法:
① 盡量稀釋一抗
② 降低抗體的電荷,如用2.5%NaCl,0.05mTBS代替PBS;
③ 用去垢劑 如triton-100處理切片。 Tween-20等;

3.二抗與組織中的Ig結合
如羊抗兔的二抗,二抗可以標本中(人)Ig發生交叉反應,科學上越接近的動物,交叉反應越
明顯,如人與猴,兔與豚鼠。
避免方法:用與待測組織相同的5%的正常血清稀釋二抗。如人血清。

4.組織中殘存醛基與Ig的結合
如醛類固定后未能徹底的沖洗,殘流醛基可以和Ig結合。
避免方法:
①徹底沖洗;
② 0.02%的新鮮的硼氧化鉀液處理10分鐘后沖洗;

5.內源性過氧化物酶
紅細胞,粒細胞的含量尤其高,鏡下可以識別,不要將其當成陽性結果。
避免方法:
① 石蠟切片 0.3%雙氧水-甲醇溶液處理切片;
② 冰凍切片 3%雙氧水處理切片5分鐘(99:1)因為未經固定包埋,大部分酶未被破壞;
③ 對于骨髓涂片
最好用非過氧化物酶標記的抗體
如堿性磷酸酶(AP)

磷酸萘酯 水→α-萘酚 偶氮染料

快蘭(fast blue)或快紅(fast red)
↓ ↓
蘭色 紅色
用明膠甘油封片,不能用含二甲苯的封片劑,溶于二甲苯。

6. 內源性生物素
以 24mg/ml的卵白素封片15分鐘;
7. 交叉反應
PcAb敏感性高,但特異性稍低,容易出現非特異性染色。
避免方法:
①盡可能稀釋抗體;
②盡可能用McAb;

三、 抗體最大稀釋度的求法
最大稀釋度的目的:
1.節約、
2.特異性染色↑、非特異性染色↓(決定其最大稀釋度)
棋盤法
如 稀釋度
1:50 1;100 1:150 1;200
特異性染色
非特異性染色 - -

 
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