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非標記抗體免疫電鏡操作步驟

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-27

1.經典法
(1)將被檢病毒材料0.9ml,加1︰5~1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。
(2)置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃過夜。
(3)以17 000r/min~23 000r/min離心90min。
(4)吸去上清,將離心管口倒置于濾紙上,吸去殘留液體。
(5)沉淀物中加少量H2O混懸,用3%磷鎢酸(pH6.0)負染20Sec~30Sec,滴加于400目銅網Fomnvar膜上,用濾紙從銅網邊緣輕輕吸去多余的負染液。
(6)在透射電鏡下4×104倍觀察。
2.快速法(瓊脂擴散法)
(1)同經典法(1)、(2)步驟,制備免疫復合物。
(2)以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖,趁熱澆注于潔凈的載玻片上,每片3ml,待冷卻凝固后,在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數粒,再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml~3ml,冷卻凝固后,取出玻璃珠,使凝膠形成凹孔。
(3)將普通濾紙剪成2×3cm大小,3~4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個凹孔,平放在濾紙上。
(4)在凹孔內,加入制備好的含病毒的免疫復合物懸液。
(5)將電鏡載網的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上。由于瓊脂糖的吸水作用,20min~30min后,可將液滴的水分吸干,而濃縮的免疫復合物則粘附在載網膜上。
(6)在載網膜上滴加3%磷鎢酸負染20Sec,過量的負染液用濾紙在載網邊緣輕輕吸去。
(7)于透射電鏡4×104倍下觀察。

 

 
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