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簡易過碘酸鈉法制備HRP結合物

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-27

  本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與Ig上的氨基相結合,所獲酶標記抗體的產率高,將近70%的HRP和Ig結合,99%的Ig與酶結合,酶與Ig的活性無重大損失,是目前最常用的方法。

  1. 原理:經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連,形成斯夫氏鹼,后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。

  2. 標記步驟:
  (1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
  (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室溫下避光攪拌20分鐘。
  (3) 將上述溶液裝入透析袋中,對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析,4℃過夜。
  (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗體,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中,室溫避光輕輕攪拌2小時。
  (5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混勻,再置4℃2小時。
  (6) 將上述液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4 PBS透析,4℃過夜。
  其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。

  3. 結果判定:
  除標記物IgG量的計算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。
  IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

  4. 試劑及器材:
  (1) 0.1M NaIO4:稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠,批號830602)溶于蒸餾水10ml中。
  (2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:
  0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
  0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
  加蒸餾水至2,000ml。
  (3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:
       Na2CO3 0.32克
       NaHCO3 0.586克
       加蒸餾水至50ml
  再用蒸餾水作20倍稀釋,即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

  (4) NaBH4溶液(4mg/ml):
  臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。

  (5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

 
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