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免疫組化常見問題及對策

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-27

1、染色過強

原因

解決辦法

抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長 降低抗體滴度(一般指濃縮性抗體)抗體孵育時間:室溫1小時或4℃過夜
孵育溫度過高,孵育溫度超過37 一般室溫20-28
DAB顯色時間過長或DAB濃度過高 顯色時間不能超過5-10分鐘,以顯微鏡下觀察為準

2、非特異性背景染色

原因

解決辦法

操作過程中沖洗不充分

每步沖洗3×5

組織中含過氧化物酶未阻斷

可再配置新鮮3%H2O2封閉,孵育時間延長

組織中含內源性生物素

正常非免疫動物血清再封閉

血清蛋白封閉不充分

延長血清蛋白封閉時間

3、染色弱

原因

解決辦法

抗體濃度過低,孵育時間過短

提高抗體濃度,孵育時間不能少于60分鐘

試劑超過有效使用期

及時更換試劑

操作中,滴加試劑時緩沖液未瀝干,致使試劑稀釋

每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液(但防止切片干燥)

室溫太低,低于15

若室溫低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘(或4℃冰箱過夜)

蛋白封閉過度

封閉時間不要超過10分鐘

4、染色陰性

原因

解決辦法

操作步驟錯誤

重新試驗,設立陽性對照

組織中無抗原

設立陽性對照片,以驗證實驗結果

一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗與二抗種屬無誤

 
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