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高壓電泳

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

原理

同普通電泳。普通電泳的電壓一般為2V/cm~20V/cm,電泳時(shí)間需1小時(shí)至數(shù)小時(shí)。電泳時(shí)間越長,擴(kuò)散越嚴(yán)重。對于一些小分子的物質(zhì)如核苷酸、氨基酸、多肽等,在常壓電泳中,往往達(dá)不到分離的目的。高壓電泳則能使分子量相近的物質(zhì)充分地進(jìn)行分離。在高壓電泳中,電壓可達(dá)到50V/cm~200V/cm,高壓電源達(dá)1 500V~1 0000V,電流可達(dá)50mA~400mA.電壓越高,分離時(shí)間越短,所以在高壓電泳中,一般只需較短的時(shí)間,數(shù)十分鐘,有的甚至數(shù)分鐘即可達(dá)到分離的目的。

高壓電泳廣泛地用于核苷、核苷酸、氨基酸、多肽、糖、生物堿、有機(jī)酸等的分離。

高壓電泳中最大的問題是冷卻,常用的冷卻方式有三種,即固體冷卻、液體冷卻和氣體冷卻。其中以液體冷卻設(shè)備簡單、效果也好。液體冷卻劑的選擇必須遵循以下幾點(diǎn):①與緩沖液互溶性小;②不溶解樣品;易從紙上除去;不以爆炸;蒸汽不是劇毒性物質(zhì)。一般常用的冷卻劑有甲苯、四氯化碳、液體石蠟、氯苯、正己烷、乙庚烷等。以甲苯冷卻效率最高。


材料與試劑

1.0.05mol/L pH4.85檸檬酸緩沖液

2.5-AMP、ADP、ATP,每種核苷酸溶液的濃度為5mg/ml。

3.AMP-ADP-ATP混合液。取上述三種核苷酸溶液等體積混合而成。

4.點(diǎn)樣管、毛細(xì)管

5.新華1號濾紙

6.玻璃噴霧器

7.高壓電泳儀

8.聚乙烯膜等


操作方法

1.剪紙 剪適當(dāng)大小濾紙,一般為60cm×10cm。

2.點(diǎn)樣 點(diǎn)樣的位置取決于樣品的性質(zhì)和緩沖液的pH,如不明確泳動方向,則點(diǎn)中線處。核苷酸在pH2~5均帶負(fù)電荷,點(diǎn)靠負(fù)極一些。量為50μg~100μg,要求分離后每個(gè)斑點(diǎn)在5μg以上,否則在紫外燈下很難檢查出來。點(diǎn)樣時(shí),樣品越少越好,樣品劑量較大時(shí),可邊點(diǎn)邊用吹風(fēng)機(jī)吹干,分?jǐn)?shù)次點(diǎn)。注意勿傷紙面,不要把紙刮毛或弄皺。

3.電泳 以0.05Mol/L pH4.85檸檬酸緩沖液,用玻璃噴霧器將濾紙噴濕,然后將噴濕的濾紙夾在二濾紙之間,以吸去多余的液體。將濕濾紙夾在兩張聚乙烯膜之間,該膜使濾紙與冷卻板絕緣,將此“夾層”夾在兩塊冷卻板之間,旋緊冷卻板的螺絲。在濾紙兩頭與電極槽緩沖液之間用數(shù)層濾紙搭橋,將電泳儀上的安全蓋蓋好,把冷卻板上入水孔用橡皮管連上。將電表頭電壓調(diào)至4 000V,此時(shí)電流為28mA~30mA,相當(dāng)于電勢差66.6V/cm,電流2.8mA/cm~30mA/cm,通電20min,斷電。迅速取出濾紙,吹干。


結(jié)果判定

用紫外燈(波長260nm)觀察濾紙上的核苷酸分離情況。參照核苷酸的移動位置,可以確定結(jié)合物(樣品)中有何種核苷酸。也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件,先確定各種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的遷移率作為分析的依據(jù)。

 
鏇村

 

 
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