原理

同普通電泳。普通電泳的電壓一般為2V/cm~20V/cm，電泳時(shí)間需1小時(shí)至數(shù)小時(shí)。電泳時(shí)間越長，擴(kuò)散越嚴(yán)重。對于一些小分子的物質(zhì)如核苷酸、氨基酸、多肽等，在常壓電泳中，往往達(dá)不到分離的目的。高壓電泳則能使分子量相近的物質(zhì)充分地進(jìn)行分離。在高壓電泳中，電壓可達(dá)到50V/cm～200V/cm，高壓電源達(dá)1 500V～1 0000V，電流可達(dá)50mA～400mA.電壓越高，分離時(shí)間越短，所以在高壓電泳中，一般只需較短的時(shí)間,數(shù)十分鐘，有的甚至數(shù)分鐘即可達(dá)到分離的目的。

高壓電泳廣泛地用于核苷、核苷酸、氨基酸、多肽、糖、生物堿、有機(jī)酸等的分離。

高壓電泳中最大的問題是冷卻，常用的冷卻方式有三種，即固體冷卻、液體冷卻和氣體冷卻。其中以液體冷卻設(shè)備簡單、效果也好。液體冷卻劑的選擇必須遵循以下幾點(diǎn)：①與緩沖液互溶性小；②不溶解樣品；易從紙上除去；不以爆炸；蒸汽不是劇毒性物質(zhì)。一般常用的冷卻劑有甲苯、四氯化碳、液體石蠟、氯苯、正己烷、乙庚烷等。以甲苯冷卻效率最高。

材料與試劑

1．0.05mol/L pH4.85檸檬酸緩沖液

2．5－AMP、ADP、ATP，每種核苷酸溶液的濃度為5mg/ml。

3．AMP－ADP－ATP混合液。取上述三種核苷酸溶液等體積混合而成。

4．點(diǎn)樣管、毛細(xì)管

5．新華1號濾紙

6．玻璃噴霧器

7．高壓電泳儀

8．聚乙烯膜等

操作方法

1．剪紙 剪適當(dāng)大小濾紙，一般為60cm×10cm。

2．點(diǎn)樣 點(diǎn)樣的位置取決于樣品的性質(zhì)和緩沖液的pH，如不明確泳動方向，則點(diǎn)中線處。核苷酸在pH2～5均帶負(fù)電荷，點(diǎn)靠負(fù)極一些。量為50μg～100μg，要求分離后每個(gè)斑點(diǎn)在5μg以上，否則在紫外燈下很難檢查出來。點(diǎn)樣時(shí)，樣品越少越好，樣品劑量較大時(shí)，可邊點(diǎn)邊用吹風(fēng)機(jī)吹干，分?jǐn)?shù)次點(diǎn)。注意勿傷紙面，不要把紙刮毛或弄皺。

3．電泳 以0.05Mol/L pH4.85檸檬酸緩沖液，用玻璃噴霧器將濾紙噴濕，然后將噴濕的濾紙夾在二濾紙之間，以吸去多余的液體。將濕濾紙夾在兩張聚乙烯膜之間，該膜使濾紙與冷卻板絕緣，將此“夾層”夾在兩塊冷卻板之間，旋緊冷卻板的螺絲。在濾紙兩頭與電極槽緩沖液之間用數(shù)層濾紙搭橋，將電泳儀上的安全蓋蓋好，把冷卻板上入水孔用橡皮管連上。將電表頭電壓調(diào)至4 000V，此時(shí)電流為28mA~30mA，相當(dāng)于電勢差66.6V/cm，電流2.8mA/cm~30mA/cm，通電20min，斷電。迅速取出濾紙，吹干。

結(jié)果判定

用紫外燈（波長260nm）觀察濾紙上的核苷酸分離情況。參照核苷酸的移動位置，可以確定結(jié)合物（樣品）中有何種核苷酸。也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，先確定各種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的遷移率作為分析的依據(jù)。