材料與方法

1．抗原動物及免疫方法 抗原為哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的馬傳貧病毒株培養(yǎng)物制備的可溶性抗原。免疫動物為6～8周齡的Balb/c鼠。初次免疫用含完全佐劑抗原0.2ml（病毒含量為1.0×108／ml制備的可溶性抗原）腹腔接種，經(jīng)2周再次免疫接種，應用不完全佐劑抗原0.2ml腹腔接種，再經(jīng)3周強化免疫，接種可溶性抗原0.3ml，3天后取脾臟。

2．細胞培養(yǎng) SP2/0鼠骨髓瘤胞株，培養(yǎng)液為含0.025Mol/L HEPES的RPMI－1640（pH7.3），另加新生牛血清15％NEAA液1％，丙酮酸鈉（1.1％）和谷氨酰胺（2.92％）各1％，青鏈霉素（100U或µg/ml）1％，39℃CO2培養(yǎng)箱中孵育，CO2濃度為5％。

3．細胞融合及克隆化 取SP2/0鼠骨髓瘤細胞1.0×107/ml和脾細胞2.0×107個/ml，離心沉淀棄上清，然后向細胞沉淀中加入細胞融合劑0.7ml（50％PEG 4 000），按常規(guī)細胞融合程序進行。用HAT完全培養(yǎng)基做稀釋，培養(yǎng)在事先加有飼養(yǎng)細胞的24孔細胞培養(yǎng)板中，經(jīng)7天具有雜交瘤細胞增殖，形成有數(shù)十個細胞菌落。當對其培養(yǎng)上清液檢查抗體為陽性時，以96孔培養(yǎng)板有限稀釋法和鋼杯法將細胞做克隆化培養(yǎng)和增殖，然后轉入細胞培養(yǎng)瓶中進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

4．抗體檢測及鑒定
(1) ELISA法：HRP標記兔抗鼠Balb/c結合物（北京生物制品研究所購買），用MR580微量ELISA自動讀數(shù)儀判讀結果。

(2) IF法：直接法用兔抗鼠Balb/c IgG熒光抗體診斷血清對雜交瘤細胞染色，對照用SP2/0細胞，間接法用感染馬傳貧病毒的驢胎皮膚細胞及其正常驢胎皮膚細胞分別載于涂片上丙酮固定后，加A4、A5及C4培養(yǎng)物上清液，置37℃30min，然后用PBS洗滌三次，再用兔抗鼠Balb/c IgG熒光抗體診斷血清，置37℃30min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察，并用SP2/0細胞培養(yǎng)物上清做陰性對照。鏡下細胞呈綠色熒光者判為陽性。

(3) 瓊脂免疫雙擴散法

(4) SDS—PAGE法

(5) McAb的純化，以雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)液和腹水做SPA－Sepbarosecl－4B親和層析。

(6) 雜交瘤細胞染色體的檢測

(7) 中和試驗和補體結合試驗

結果

1．雜交瘤細胞的篩選 融合后的細胞接種在24孔細胞培養(yǎng)板上，第7天融合細胞開始增殖，經(jīng)ELISA和IF篩選，獲得A4、A5及C4三個分泌馬傳貧病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株。

2．馬傳貧雜交瘤細胞的染色體組型分析 SP2/0骨髓瘤細胞染色體數(shù)為72，Balb/c鼠脾細胞染色體數(shù)為40，雜交瘤細胞系A4為97.80±3.87；A5為 100.93±5.50；C4為98.10±4.47。

3．馬傳貧雜交瘤細胞分泌抗體的動力學 對A 4、A5 和C4三株雜交瘤細胞1~60代培養(yǎng)上清液進行了ELISA檢測，A4、A5兩株抗體分泌較為穩(wěn)定，C4株的抗體分泌有逐漸減少的趨勢。

4．馬傳貧雜交瘤細胞分泌抗體的特異性 以A 4、A5 和C4雜交瘤細胞培養(yǎng)液分別給Balb/c鼠腹腔接種后引起的腹水及該鼠的抗血清同馬傳貧病毒（遼系毒和黑系毒）。能感染馬匹的乙腦病毒和同為逆轉錄病毒科的牛白血病病毒抗原進行ID、CF及ELISA檢測，僅見同馬傳貧抗原呈陽性反應，其余皆陰性。