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酶標抗體的鑒定

放大字體  縮小字體 發布日期:2006-06-28

1.酶標抗體的活性鑒定 一般以瓊脂擴散和免疫電泳進行鑒定。使酶標抗體和相應的抗原(抗原濃度為1mg/ml)產生沉淀線,洗滌后于底物溶液中顯色,顯色后用生理鹽水漂洗,沉淀線不褪色,說明酶和抗體都具有活性。良好的酶標結合物瓊脂擴散滴度一般應在116以上。

2.酶結合物的定量測定 包括酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結合率的測定。

酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42

1)戊二醛法:IgG(mg/ml)=(OD280nmOD403nm×0.42)×0.94×0.62

(OD403×0.42為酶在403nm的光密度,抗體與酶-戊二醛結合后OD280nm約增加6%,所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0時為0.62mg,所以又乘以0.62)

2)過碘酸鈉法:IgG(mg/ml)=(OD280OD403×0.30)×0.62

(3)克分子比值=(ug/m) /40000/[(IgG mg/ml) / 160 000]=X4 /IgG

(40 000160 000分別為辣根過氧化物酶和IgG的分子量)

酶結合率=結合物中的酶量/標記時加入的酶量×100%

酶標記率:OD403nm/OD280nm即酶中正鐵血紅素輔基的吸光度(403nm)與抗體-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRPAbE中所占的比例,它與E/Ab克分子比值呈高度正相關。

3.酶結合物的質量標準 純化的酶結合物的質量標準應包括以下幾個方面。

1)酶的催化活性。

2)免疫學活性。

3)未聯接的游離酶的量。

4)未聯接的原始免疫反應物的量。

5)每個酶分子所聯接的免疫反應物分子數目。

6)生化性質。

7)酶標記免疫試驗效果。

酶結合物的質量差異,可引起試驗敏感度的很大變化。例如用不同的程序制得的HRPIgG結合物進行酶標記免疫試驗,可得到不同的試驗結果,故應予重視。

用于ELISA酶標抗體的各項指標參數

評價

最好

一般

酶結合量(mg/ml)

1.0

0.5

0.4

酶結合率(%)

30

910

7

IgG克分子比

1.5

1.0

0.7

 
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