材料與試劑
1．α－萘酚液
α一苯酚 1.00g
40%乙醇 100.00ml
3%H2O2 0.20ml
混合即可,現(xiàn)用現(xiàn)配。
2．派洛寧液
派洛寧(Pyroming) 0.10g
苯胺(Aniline) 4.00g
40%乙醇 96.00ml
3．內(nèi)源性酶抑制劑：0.01%H2O2的0.01%的疊氮鈉溶液。
1%H2 O2 1.00ml
1%Na N3 1.00ml
0.015mol/L pH 7.4 PBS液 100.00ml
4．0.05Mol/L pH 7.6 Tris－HCl緩沖液
A液：0.2mol/L Tris液
三羥甲基氨基甲烷 2.43g
H2 O 100.00ml
B液：0.1mol/L HCl
取A液25ml，B液38.9ml，混合，加蒸餾水至100ml即可。
5．DAB液(Karnovsky液)
0.05Mol/L pH 7.6 Tris－HCl緩沖液 100.00ml
3，3－二胺基聯(lián)苯胺鹽酸鹽 76mg
1% H2 O2 0.5ml
配后立即使用。
6．0.10Mol/L pH7.4 PBS液。
操作方法
1．豬瘟酶標(biāo)抗體工作滴度的確定 對(duì)組化法來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的確定工作滴度的方法是將酶標(biāo)抗體進(jìn)行一系列的倍比稀釋，然后對(duì)已知陽(yáng)性標(biāo)本片進(jìn)行染色，以最為清晰的陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)或稍提高1～2滴度作為工作滴度。
購(gòu)買(mǎi)商品豬瘟酶標(biāo)抗體,則按其說(shuō)明的工作濃度稀釋即可。
2．待檢標(biāo)本片的制作 取可疑豬瘟病豬尸體或急宰病豬立即剖檢，采取腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器進(jìn)行觸片(或涂片)或冷凍切片(4µm厚度)。余下組織低溫冰箱保存或放于盛有50%甘油鹽水中于普通冰箱保存，以備復(fù)檢或比較用。也可采病豬之血作血球粥片。標(biāo)本片干后，立即以4℃的丙酮液固定15min。固定后的標(biāo)本片可貯藏于4℃冰箱中備用。
3．染色方法 采用單染法和復(fù)染法均可，萘酚復(fù)染法操作過(guò)程：
⑴ γ－苯酚液染色4min～5min。
⑵ 0.015Mol/L pH7.4 PBS液沖洗10min。
⑶ 派洛寧液染2min。
⑷ PBS沖洗后，用吸水紙吸除水滴。
⑸ 滴加工作濃度的酶標(biāo)抗體液，以復(fù)蓋為度，置濕盒內(nèi)37℃溫育30min~45min，PBS液沖洗。
⑹ 加DAB液室溫染色30min；
⑺ PBS液沖洗后，餾水中漂洗；
⑻ 干燥后，無(wú)水酒精脫水5min，二甲苯透明5min，加拿大膠封片。
DAB單染法：
⑴ 滴加內(nèi)源性酶抑制劑30min。
⑵ 0.015Mol/L pH 7.4 PBS沖洗液10min。
以下步驟同復(fù)染法⑸～⑻。
2．對(duì)照組的設(shè)置：首次染色時(shí),應(yīng)設(shè)立如下對(duì)照。
⑴ 已知陽(yáng)性標(biāo)本的對(duì)照。
⑵ 已知陰性標(biāo)本的對(duì)照。
⑶ 抗體抑制試驗(yàn)對(duì)照，即在標(biāo)本上加有與酶標(biāo)抗體來(lái)源不同的另一個(gè)體的抗豬瘟抗體處理(37℃作用45min)。再以酶標(biāo)抗體染色應(yīng)為陰性。
⑷ DAB－H2O2底物染色對(duì)照，即不加酶抗體，只加DAB－H2O2液。以檢查內(nèi)源性酶被抑制的情況。
結(jié)果判定
在對(duì)照組成立的前提下，α－萘酚復(fù)染法：在細(xì)胞漿內(nèi)酶標(biāo)抗體抗原復(fù)合物呈黃褐色,內(nèi)源性酶被染成紅色,背景為淺棕色；單染法：在細(xì)胞漿內(nèi)，酶標(biāo)抗體抗原復(fù)合物呈黃褐色,背景成淡黃色或無(wú)色。
注意事項(xiàng)
1．標(biāo)本必須新鮮，否則非特異性反應(yīng)重。
2．固定劑的選擇應(yīng)以不影響抗原的活性又不妨礙抗體進(jìn)入細(xì)胞為原則。病毒標(biāo)本的固定劑一般選用冷甲醇和丙酮。
3．消除內(nèi)源性酶的辦法：
⑴ 以0.30％～3%H2O2液室溫處理標(biāo)本15min～30min；
⑵ 0.10%苯肼37℃處理1h；
⑶ 0.074%鹽酸乙醇液(100ml乙醇含0.20ml濃鹽酸)，室溫處理15min。
4．消除背景染色的辦法 背景染色可以是特異性的，因?yàn)榧?xì)胞漿的外溢和炎性浸潤(rùn)造成。但大量的是非特異性的，主要是由于組織成分對(duì)免疫球蛋白的非特異性吸附所致，可以采用以下辦法消除。
⑴ 切片以0.30％～3% H2O2作用后,再以10%卵蛋白作用30min。
⑵ 以0.05%吐溫-20和含有0.10%牛血清白蛋白的PBS液預(yù)處理。
如果采用間接法測(cè)定抗原，則可采用下法來(lái)消除背景的染色。
⑶ 以與第一血清不同種類的正常動(dòng)物血清做預(yù)處理。
⑷ 用來(lái)自于酶標(biāo)記第二抗體的同種動(dòng)物的血清做預(yù)處理,也可用這種血清來(lái)稀釋第一抗體。
5．抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度的確定 直接法測(cè)定的酶標(biāo)抗體濃度是以不同梯度的稀釋經(jīng)過(guò)試驗(yàn)而定。間接法測(cè)定的第一抗體濃度和第二酶標(biāo)抗體濃度的確定，則必須進(jìn)行雙方陣試驗(yàn)預(yù)以選擇。抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度的確定均不宜過(guò)高或過(guò)低。過(guò)高易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，過(guò)低則影響檢出的敏感性。